[发明专利]一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法

权利要求书

1.一种提高海藻过表达基因遗传转化效率的方法，其特征在于：

其为基因枪介导转化方法，将转化质粒与金粉混合，然后用基因枪将金粉轰击进海藻中，进行培养获得转基因苗；海藻为条斑紫菜；转化质粒为带有功能基因CDS区的过表达质粒；

所述金粉为不同粒径的混合金粉，混合金粉中粒径为0.6-0.8微米平均粒径0.65-0.75微米的金粉占混合金粉质量的30-50%，粒径为0.8-1.5微米且不为0.8微米平均粒径1.0-1.2微米的金粉占混合金粉质量的50-70%。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：混合金粉中粒径为0.6-0.8微米平均粒径0.68-0.72微米的金粉占混合金粉质量35-45%，粒径为0.8-1.5微米且不为0.8微米平均粒径1.05-1.15微米的金粉占混合金粉质量55-65%。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：具体过程为，

1）金粉溶液制备：称取 24-26 mg混合金粉，混合金粉中粒径0.6-0.8微米金粉占混合金粉质量的30-50%，粒径大于0.8至1.5微米金粉占混合金粉质量的50-70%, 加入容器中,向容器中加入0.8-1.5 ml 60- 80% V/V乙醇和0.8- 1.5 ml 超纯水，震荡洗涤，离心后，弃上清；用400-600 μl V/V为 45-55%甘油溶解，混匀；

2）微弹制备： 取上述金粉溶液48-50μl与6-8 μg转化质粒混匀，然后加入40-60 μl2.3-2.7M的 CaCl₂ , 15-25 μl 0.1-0.15M的亚精胺，8000-12000 g离心2-5秒，弃上清，然后用48-50 μl无水乙醇溶解；

3）将48-50 μl微弹平均分配到4-6张载体膜上，然后用氦压1.2-1.5Mpa，真空压力达到3-5英寸汞柱时采用基因枪轰击实验材料海藻，每张载体膜对应8-10 mg新鲜海藻；

4）轰击后的海藻先黑暗培养18-30h后，再按照海藻的正常培养条件进行培养。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：

正常培养条件，用含抗生素的培养基培养6-8周后，挑选单棵条斑紫菜苗，每棵苗对应一个培养瓶培养，挑选10-20棵苗进行培养检验；培养4-6周待长成后，提取其基因组DNA，然后进行PCR扩增以筛选突变株。

5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：

黑暗培养为 15-19℃黑暗18-30h ；

正常培养为15-19℃，光照强度2500-3500 lux，光暗时间比10-12：14-12=L:D条件下培养。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述功能基因为紫菜的丙酮酸羧化酶PYC或其它来自条斑紫菜的功能基因PEPC，MDH和PEPCK中的一种。

7.按照权利要求1、2或6所述的方法，其特征在于：

功能基因CDS大小为1100-3400个碱基；

所述功能基因的CDS序列插入质粒的启动子终止子之间。