[发明专利]一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法

权利要求书

1.一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将鸡胚用75％酒精消毒后，用镊子敲碎气室端蛋壳，挑出整个鸡胚置于装有37℃的不含钙镁的PBS溶液的无菌培养皿中冲洗干净，然后分离腿部转移至干净的培养皿中，用镊子和手术剪剪去除软骨外的肌肉和骨膜，分离出软骨，将软骨组织剪碎后进行离心处理，弃上清液；

(2)在剪碎的软骨组织碎片中加入胰蛋白酶，在37℃水浴中进行消化处理，期间每隔10min轻摇离心管几次，然后加入纯胎牛血清终止消化，离心后弃上清，再加入Ⅱ型胶原酶，水浴消化至组织块呈悬浊状，期间每隔10min轻颠离心管几次；

(3)将上述悬浊液用细胞筛网过滤，将过滤后的滤液离心处理后弃去上清液，加入完全培养液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀重悬利用，得到软骨细胞；

(4)将分离的软骨细胞接种于细胞培养皿中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

2.根据权利要求1所述的一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的鸡胚的胚龄为15天，离心转速为1000r/min，离心时间为5min。

3.根据权利要求1所述的一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25％，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.2％，消化时间均为30-40min。

4.根据权利要求1所述的一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的细胞筛网的目数为200目，离心转速为800-1000r/min，离心时间为4-6min。

5.根据权利要求1所述的一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的软骨细胞按照1×10⁴个/孔的密度铺板细胞培养皿。

6.一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)鸡原代软骨细胞培养至第3天时，制作细胞爬片，将细胞接种至12孔板中，放入培养箱中；细胞爬片第二天弃去培养液，利用温育的PBS溶液冲洗两次，加入细胞固定液，细胞固定后，弃去固定液，利用PBS清洗3次；

(2)PBS清洗之后，加入封闭液，室温静置，弃去封闭液，PBS清洗3次，加一抗过夜；

(3)将一抗回收，PBS清洗3次，然后加入二抗，室温静置后弃去二抗，PBS清洗；

(4)加DAPI复染，室温静置后弃去DAPI，PBS清洗后加入少量PBS于培养孔中；在载玻片上加抗荧光淬灭剂，从培养孔中取出玻片铺于载玻片上，荧光显微镜下拍照。

7.根据权利要求6所述的一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(1)中，加入细胞固定液后，细胞在室温固定15-20min。

8.根据权利要求6所述的一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(2)中，加入封闭液后细胞在室温下封闭2h，一抗在4℃条件下孵育过夜。

9.根据权利要求6所述的一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(3)中在避光条件下加入二抗，室温静置2h。

10.根据权利要求6所述的一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，其特征在于：所述步骤(4)中的DAPI复染时间为5-10min。