[发明专利]一个兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗

说明书

本发明公开了一种兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗，所述双价弱毒疫苗含有CMV_Fny分离物的突变型RNA2；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2是在CMV_Fny分离物的RNA2全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段烟草花叶病毒的保守序列；所插入的烟草花叶病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将本发明的双价弱毒疫苗是将CMV_Fny分离物的突变型RNA2与含有CMV_Fny分离物RNA1和RNA3的质粒混合接种，可以预防黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的危害。本发明的双价弱毒疫苗对CMV和TMV具有交叉保护效果；为田间防治CMV和TMV引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一个兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗及其在防治黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒中的应用。

背景技术

病毒病是仅次于真菌病的第二大类植物病害，对绝大部分作物均造成不同程度的危害，植物病毒病的防治是研究热点及难点问题。黄瓜花叶病毒(Cucumer mosaic virus，CMV)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，造成多种具有重要经济价值的植物(农作物、园艺作物等)出现黄化、矮化、畸形等症状，严重影响其产量和品质(Mochizuki etal.,2012)。烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是危害烟草、番茄和马铃薯的主要病毒，侵染烟草可引起花叶及疱斑等症状，严重影响烟叶产量及品质(姜翰林等，2018)。

在自然界中，不同病毒侵染同一寄主植物后有时会加重病毒病的症状，这种现象叫做协生作用。植物病毒协生现象在自然界广泛存在，黄瓜花叶病毒与烟草花叶病毒复合侵染造成的危害更大，因此，设计能够兼抗两种病毒的策略尤为重要。

对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒突变体侵染，诱导植物自身的免疫系统而防治后期侵染的同样类型强病毒株系；是一种有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。

一种弱毒突变体只能用来防治对应的强病毒，如果想同时防治不同的病毒，就需要几种不同类型的弱毒突变体。但可以通过在一个骨架病毒中插入异源病毒片段，来达到既防治骨架病毒，又防治插入片段对应的病毒的效果，这种突变型病毒就是多价弱毒疫苗。以黄瓜花叶病毒为基础病毒载体，能够兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗目前还未见有报道。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的目的是提供一种兼抗CMV和TMV的双价弱毒疫苗，为田间防治CMV和TMV引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗，所述双价弱毒疫苗含有CMV_Fny分离物的突变型RNA2；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2是在CMV_Fny分离物的RNA2全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段烟草花叶病毒的保守序列；所插入的烟草花叶病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供上述兼抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的双价弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：