[发明专利]猪流行性腹泻病毒疫苗株及其制备方法

说明书

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒疫苗株及其制备方法，所述疫苗株为将FJzz1在Vero细胞连续传至200代获得。选取低代次FJzz1‑F20和高代次FJzz1‑F200毒株对仔猪进行了致病性评价，结果显示高代次FJzz1‑F200感染组仔猪临床表现明显轻于FJzz1‑F20感染组，且发病猪未有死亡。与FJzz1‑F20感染组相比，FJzz1‑F200感染组仔猪的粪便排毒量和肠组织中的病毒载量显著降低，且肠道组织无明显组织病理学改变。同时，检测发现FJzz1‑F200感染组在肠组织中可以诱导高水平的I型和III型干扰素产生。上述研究结果表明，本发明的FJzz1‑F200其致病性弱，具有作为PEDV候选弱毒疫苗毒株的潜力。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及猪流行性腹泻病毒的一株弱毒疫苗株的制备及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种引起哺乳仔猪严重腹泻、高发病率和高死亡率的高度接触性肠道传染病，由猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染引起。PEDV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科、α-冠状病毒属的成员，其基因组全长大约28Kb，包括带有帽子结构的5’-UTR、含有poly A尾的3’-UTR以及7个开放阅读框(ORF)组成，主要编码包括聚合酶蛋白pp1a、pp1ab、纤突蛋白(S)、辅助蛋白ORF3、膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)(Song and Park 2012)。其中S蛋白的主要功能是识别宿主细胞受体并介导细胞膜融合，在病毒感染侵入过程中发挥重要作用。由于S蛋白位于囊膜外部，易于发生突变，尤其S1-NTD区域突变率较高，因此S基因常被用于分析不同PEDV毒株之间的遗传多样性(Lin et al.2017；Chen et al.2019)。有研究表明S蛋白与PEDV的毒力相关，当缺失S蛋白S1的NTD区域部分氨基酸后PEDV对仔猪的致病性可显著降低(Hou etal.，2017；Hou et al.，2019b)。也有研究人员通过反向遗传技术证实，S蛋白对于新型变异株PEDV的毒力是必要但不充分的(Wang et al.2018)。为了适应环境的变化和逃避宿主的免疫压力，PEDV在遗传进化过程中会不断发生变异(Lin et al.2016；Guo et al.2019)。除此而外，Nsp3和ORF3基因也是突变发生的集中区域，可能是PEDV致弱的靶基因(Zuniga etal.2016)。针对PED疫情的爆发，除了严格的生物安全措施而外，疫苗免疫在预防和控制PED中仍然发挥至关重要的作用。目前，以经典病毒株和流行性强毒株为种毒研制的灭活疫苗以及减毒活疫苗在我国已经被广泛使用，对控制PED疫情的发生和流行发挥了重要作用。但是，有研究认为针对PEDV的感染粘膜免疫发挥决定性作用，尤其是乳汁中的分泌型IgA(sIgA)被认为抗PEDV感染的主要抗体。然而，与灭活疫苗相比减毒活疫苗可诱导产生高水平的sIgA，因此其更具开发潜力(Chattha et al.2015；Langel et al.2016)。

目前国内现有商品化弱毒疫苗主要是猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎二联活活疫苗以及猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒三联活疫苗，这些疫苗使用的毒株主要是源自于经典猪流行性腹泻病毒CV777株而来，而经典毒株与目前国内的流行毒株存在较大基因变异，其核苷酸同源性低于97％，其中S蛋白在经典毒株与流行毒株之间其核苷酸同源性为91.9％-93.5％，而氨基酸同源性为90.1％-92.0％，这种差异会导致现有疫苗毒株对变异流行毒株的交叉保护能力受到明显限制，无法很好地抵抗流行毒株的感染。因此，尽管上述疫苗已在被普遍应用，但由于重新出现的PEDV株的抗原不断变异，使得现有基于经典毒株研制的弱毒疫苗对变异的流行毒株的交叉保护不足，造成临床效果不理想，导致仔猪腹泻疫情在我国依然呈现地方性和季节性流行。