[发明专利]一种腺苷工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种腺苷工程菌，其特征在于：是由下述方法制备得到的：在含pREDCas9质粒的大肠杆菌E.coli W3110的基因组上构建嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD，将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，所述大肠杆菌假基因yjiV的原始基因序列为序列表SEQ ID NO:1所示序列，还将腺苷琥珀酸合酶基因purA连接Ptrc启动子整合在大肠杆菌假基因位点yghE上；在大肠杆菌mbhA基因位点整合了核苷酸磷酸酯酶基因yfkN，并用启动子Ptrc启动，敲除guaB、add、amn、ygdH和deoD基因，所述嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD以及purA基因和yfkN基因均来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XGL。

2.权利要求1所述腺苷工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：在含pREDCas9质粒的大肠杆菌E.coli W3110的基因组上构建嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD，将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，并由Ptrc启动子启动；还在假基因位点yghE上整合了purA基因，用Ptrc启动子启动；在大肠杆菌mbhA基因位点整合了yfkN基因，并用启动子Ptrc启动，敲除guaB、add、amn、ygdH和deoD基因，所述嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD以及purA基因和yfkN基因均来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XGL。

3.根据权利要求2所述的腺苷工程菌的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对大肠杆菌进行定向基因改造，包括如下步骤：

（1）将嘌呤核苷操纵子purEKBCSQLFMNHD整合在大肠杆菌假基因yjiV位点上，并用强启动子Ptrc启动；

（2）purA基因整合在大肠杆菌假基因位点yghE上，并链接Ptrc启动子；

（3）在大肠杆菌mbhA基因位点整合了yfkN基因，并用启动子Ptrc启动；

（4）敲除guaB基因，阻断腺苷的前体物IMP的支路代谢；

（5）敲除amn，ygdH基因，减弱腺苷的前体物AMP的降解；

（6）敲除add和deoD基因，减弱腺苷的降解。

4.根据权利要求2所述的腺苷工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将强启动子Ptrc与purE， purK和purB基因连接后,并在purB后面插入一个剪切识别序列，整合到E.coli W3110的假基因位点yjiV上；

（2）将purCSQ基因依次整合在purB基因的后面,在该基因后面插入靶序列gRNA-pur1-S和gRNA-pur1 -A；

（3）把purL基因整合在purQ基因的后面；

（4）把purFMN基因整合在purL基因的后面；

（5）把purHD基因整合在purN基因的后面。

5.根据权利要求4所述的腺苷工程菌的构建方法，其特征在于：在上述步骤（5）的基础上，继续进行如下操作步骤：

（6）将purA基因与Ptrc启动子连接，整合到假基因yghE位点上；

（7）把yfkN基因的前1900bp的碱基与强启动子Ptrc连接，后加识别靶序列，整合到假基因mbhA上，之后再把yfkN基因的后半部分碱基整合到前半部分碱基的后面；

（8）将guaB基因敲除，减弱前体物IMP的支路代谢，使其更多地流向腺苷的合成途径中；

（9）敲除add基因，阻断腺苷到肌苷的降解途径；

（10）敲除amn和ygdH基因，减少腺苷前体物AMP到腺嘌呤的转化；

（11）敲除deoD基因，减弱腺苷到腺嘌呤的降解途径。

6.权利要求1所述腺苷工程菌在摇瓶发酵生产腺苷方面的应用。