[发明专利]一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种抗体辣根过氧化物酶标记物，是由氨基修饰后的抗体(NH₂‑Ab)与巯基修饰后的辣根过氧化物酶(SH‑HRP)交联构成，其中所述抗体可以是任意适于抗原酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒的抗体；本发明还公开了所述标记物在制备抗原酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒中的应用。实验证实，将本发明的抗体辣根过氧化物酶标记物与酶稳定剂、稀释液结合使用，能显著提高抗体酶标记物的灵敏度和稳定性、大大降低了检测的背景值，使特异性更好，具有很大的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用，属于酶免疫技术领域。

背景技术

ELISA(酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒)是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。

抗原或抗体酶标记物对免疫分析的灵敏度及特异性具有重要的作用，是酶免疫分析检测中的关键试剂。辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，是目前最常用的蛋白酶标记物的制备原料。传统的辣根过氧化物酶标抗体，是应用酶和抗体上氨基、巯基或糖蛋白上的羟基作为交联的基团，通过过碘酸钠或戊二醛法将抗体与酶直接连接在一起。由于分子大小不同，一般一个抗体分子上仅能联接1～2个HRP分子，使检测灵敏度受到限制。同时此方法制备的抗体辣根过氧化物酶标记物再后续应用中存在检测本底较高，质量不易控制的缺点，影响ELISA类检测试剂盒的质量。

申请人研究发现利用两种化学交联剂分别与抗体、HRP进行交联，并利用交联剂上基团(NH2-、SH-)自发反应进行连接，可大大提高连接效率，并且易于进行基团配比控制。制备出的抗体辣根过氧化物酶标记物应用于抗原检测试剂盒ELISA法中活性及实验本底均优于过碘酸钠法标记的抗体辣根过氧化物酶标记物。经检索，有关此方法制备的抗体辣根过氧化物酶标记物及其应用目前还鲜见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的问题是提供一种抗体辣根过氧化物酶标记物及其制备与应用。

本发明所述抗体辣根过氧化物酶标记物，是由氨基修饰后的抗体(NH₂-Ab)与巯基修饰后的辣根过氧化物酶(SH-HRP)交联构成；其特征在于：所述氨基修饰后的抗体是以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂配制浓度为0.1mg/ml的丁二酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸酯(SMPB)溶液，取100ul并加入1ml待联接的以0.1M PBS为溶剂配制的浓度为5mg/ml、pH7.2的抗体，37℃反应30分钟制得；所述巯基修饰后的辣根过氧化物酶是以DMF为溶剂配制浓度为33.6mg/ml的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶液，取500ul并加入10ml待联接的以0.1M PBS为溶剂配制的浓度为5mg/ml、pH7.2的辣根过氧化物酶(HRP)，37℃反应30分钟后，再加入终浓度的0.1M甘氨酸和0.1M二硫苏糖醇(DTT)制得；其中，所述抗体辣根过氧化物酶标记物是将氨基修饰后的抗体(NH₂-Ab)溶液与巯基修饰后的辣根过氧化物酶溶液等体积混合，加入终浓度的0.1M碘代乙酰胺交联制得。

上述的抗体辣根过氧化物酶标记物中：所述抗体可以是任意适于抗原酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒的抗体，优选的是丙肝抗体、乙肝抗体、抗gCD59的单克隆抗体、猪瘟抗体、小鹅瘟抗体、牛或羊口蹄疫抗体、羊痘抗体或狂犬病抗体。

为长期有效的保存制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物，本发明还公开了一种配套上述抗体辣根过氧化物酶标记物使用的酶稳定剂，其特征在于：所述酶稳定剂是以制备好的抗体辣根过氧化物酶标记物为基质，加入牛血清白蛋白(BSA)并使其终浓度为10mg/ml，加入kathon并使其终浓度为10ul/ml，加入基质体积量三分之一的甘油制得；酶稳定剂的使用量是抗体辣根过氧化物酶标记物体积量的2～3倍。