[发明专利]一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-rangePCR引物组，其特征在于，所述引物组为：

Forward Primer:CCAGAGAGGTAGCCAGTCCT

Reverse Primer:TGATCCCATAGAAGTCCAGAGC。

2.一种用于检测CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1.基因组DNA提取、步骤2.LR-PCR法特异性扩增CYP2D6基因、步骤3.扩增产物纯化和步骤4.产物文库构建；

所述步骤1.提取待测样本的基因组DNA，所述待测样本类型包括：血液、组织、唾液、口腔拭子或毛发，并测定浓度；

所述步骤2.以测定浓度的待测样本基因组DNA为PCR模板，以如下引物组为PCR引物：Forward Primer:CCAGAGAGGTAGCCAGTCCT，

Reverse Primer:TGATCCCATAGAAGTCCAGAGC；

按照如下体系配置反应：

将所配置的PCR反应体系充分涡旋震荡混匀并短暂离心后，运行PCR程序。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳质检：配置0.5％琼脂糖凝胶，取产物2μl进行电泳，电压120V，电泳时间40分钟。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，

所述步骤3.扩增产物纯化：

将质检合格的PCR扩增产物用贝克曼Ampure XP磁珠进行纯化，得到纯化后的长片段产物并进行浓度测定，用于后续文库构建。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，

所述步骤4.产物文库构建：将步骤3得到的纯化产物进行高通量测序文库构建，步骤为：1)片段化；2)末端修复；3)连接接头和4)文库PCR放大。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，

所述步骤1)片段化：将纯化产物100-300ng，使用如下体系及程序进行片段化：

配置的反应体系管置于37℃恒温金属浴或者PCR仪内孵育20min，反应完成后立即用1.8X Ampure XP磁珠进行纯化，加30μL Nuclease-Free H₂O得到纯化后的终产物。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，

所述步骤2)末端修复：

片段化产物按照如下反应体系进行末端修复，配置完成后置于PCR仪运行20℃25分钟，65℃失活20分钟，4℃保存。

8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，

所述步骤3)连接接头：

按照如下反应体系配置连接接头反应体系，配置好的反应在室温反应25分钟后，进行产物纯化，得到纯化后的连接接头产物。

9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，

所述步骤4)文库PCR放大：

按照如下反应体系配置PCR反应体系。

按照如下设置PCR程序，反应完成的产物进行磁珠纯化，并测定浓度，用于上机测序。

10.一种用于权利要求2-9所述检测方法的CYP2D6基因多态性变异的Long-range PCR试剂盒，其特征在于,所述试剂盒包括所述PCR引物、高保真Phanta酶、片段化酶、末端修复酶、连接酶、扩增酶mix和缓冲液。