[发明专利]一种检测RCL的引物探针组合、试剂盒和检测方法

说明书

本发明提供了一种检测RCL的引物探针组合、试剂盒和检测方法，属于病毒检测技术领域，所述引物探针组合包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。采用本发明提供的引物探针组合从样品制备到获得检出结果不超过8h，缩短了检测周期，对RCL的检测下限为5拷贝。当样品中RCL拷贝数大于5拷贝时，阳性符合率为100％；样品中拷贝数为5拷贝时，阳性符合率为95％。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测RCL的引物探针组合、试剂盒和检测方法。

背景技术

目前慢病毒颗粒作为一种基因载体工具，已广泛应用于临床治疗研究，包括基因和细胞治疗。然而这些病毒颗粒，由于在生产过程中，经过工程化处理，是一种复制缺陷性的慢病毒。

但是，因为在慢病毒颗粒生产过程中，理论上可能产生可复制性的病毒颗粒(RCL)，故在2006年，美国颁布了基因治疗产品关于RCL的指导意见，即FDA(FOOD AND DRUGADMINISTRATION)RCR Guidance，2010年美国FDA建议需对以慢病毒为载体的临床细胞和基因治疗产品进行RCL检测。

目前，FDA推荐的检测方案是基于细胞的检测方案，整个检测方案检测时间超过6周，但是目前很多I/II期临床试验需要新鲜的细胞产品来给予受试者。显然基于细胞的RCL检测方案无法满足当前的需求，因此急需建立一种周期短的检测方案来替代目前基于细胞的RCL检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种RCL的引物探针组合、试剂盒和检测方法，采用本发明提供的引物探针组合从样品制备到检测不超过8h，就能够得到检测结果，缩短了检测周期。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测RCL的引物探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，还包括内参引物对和内参探针，所述内参引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述内参引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了一种RCL的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合。

本发明还提供了一种检测RCL的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合。

本发明还提供了一种检测RCL的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品的RNA，将所述RNA反转录为cDNA；

2)将所述步骤2)得到的cDNA以上述技术方案所述的引物探针组合进行荧光定量PCR，以提取Jurkat细胞的cDNA为背景对照；

当待测样品和背景对照的3个Ct值都为Undetermined时，待测样品中没有RCL，检测结果为阴性；

当待测样品的3个Ct值都大于背景对照的Ct值时，待测样品为阴性；

当待测样品的2个Ct值大于背景对照的Ct值，1个小于背景对照的Ct值时，待测样品为阴性；

当待测样品的2个Ct值小于背景对照的Ct值，1个大于背景对照的Ct值时，待测样品为检出结果阳性；

当待测样品的3个Ct值都小于背景对照的Ct值时，待测样品检出结果为阳性。