[发明专利]一种Net1基因细胞模型的构建方法与应用

权利要求书

1.一种Net1基因细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：培养OC细胞，用siRNA敲减所述OC细胞中的Net1基因，检测敲减效率；

步骤2：Lgr5-EGFP小鼠耳蜗，消化成单细胞后，分选出表达Lgr5细胞，在细胞培养皿中培养；用所述步骤1中敲低效率最高的siRNA，敲除所述表达Lgr5细胞中的Net1基因；

步骤3：进行细胞成球试验，观察并量化球形的数量和直径来评估所述表达Lgr5细胞的增殖能力。

2.根据权利要求1所述的Net1基因细胞模型的构建方法，其特征在于，构建shRNA作为阴性对照，用与GFP结合的无义siRNA评估转染效率。

3.根据权利要求1所述的Net1基因细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，采用N1603、N1130、N622三种不同的siRNA敲减OC细胞中的Net1基因，并选出敲减效率最佳的siRNA，执行所述步骤2中的Net1基因的敲除。

4.根据权利要求1所述的Net1基因细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1中培养OC细胞的培养液含有DMEM、10％FBS与氨苄青霉素。

5.根据权利要求1所述的Net1基因细胞模型的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：将所述步骤3中的第一代成球细胞置入培养液中，用EdU染色以及毛细胞标志物抗体标记染色，并结合细胞免疫荧光观察毛细胞分化情况。

6.根据权利要求5所述的Net1基因细胞模型的构建方法，其特征在于，所述毛细胞标志物为myosin7a。

7.根据权利要求1所述的Net1基因细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤1中，采用RT-qPCR技术检测所述OC-1细胞中Net1 RNA表达量，并与未敲低的对照组作比较，检测每种siRNA的敲低效率。

8.根据权利要求1所述的Net1基因细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤2中，采用流式细胞分选技术从含有Lgr5-EGFP细胞的单细胞悬液中分选出表达Lgr5细胞。

9.根据权利要求1～8中任一所述的细胞模型构建方法在研究毛细胞再生的中应用。