[发明专利]一种Dkk3基因小鼠模型的构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种Dkk3基因小鼠模型的构建方法与应用，属于生物技术领域。一种Dkk3基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：步骤1：培养OC‑1细胞；用siRNA敲减所述OC‑1细胞中的Dkk3基因，检测敲减效率；步骤2：取新生Lgr5‑EGFP小鼠耳蜗，消化成单细胞；从所述Lgr5‑EGFP细胞悬液中分选出Lgr5+细胞；步骤3：OC‑1细胞中敲低效率最佳的siRNA敲低Lgr5+细胞中的Dkk3基因；步骤4：进行细胞成球试验，观察并量化球形的数量和直径来评估Lgr5+细胞的增殖能力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Dkk3基因小鼠模型的构建方法与应用。

背景技术

随着人口老龄化、噪声、病毒感染、耳毒性药物滥用以及环境污染等不良因素的发展和加剧，耳聋及听力障碍人群的数量正逐步上升。耳聋已成为影响社会政治和经济的全球性健康问题，其中感音神经性聋约占耳聋患者的63％。然而，目前临床上尚无疗效确切的内耳靶向性药物可用于治疗感音神经性聋。由于哺乳动物耳蜗毛细胞不可再生，因此如何使毛细胞在损伤后修复和再生，从而在根本上治疗感音神经性聋是近年来听觉领域研究的重点。而提供一种非人类的动物模型作为研究与试验平台以表征毛细胞的修复与再生，同样具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提出了一种Dkk3基因小鼠模型的构建方法与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种Dkk3基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：培养OC细胞；用siRNA敲减所述OC-1细胞中的Dkk3基因，检测敲减效率；

步骤2：取新生Lgr5-EGFP小鼠耳蜗，消化成单细胞；从所述Lgr5-EGFP细胞悬液中分选出Lgr5+细胞；

步骤3：OC-1细胞中敲低效率最佳的siRNA敲低Lgr5+细胞中的Dkk3基因；

步骤4：进行细胞成球试验，观察并量化球形的数量和直径来评估Lgr5+细胞的增殖能力。

可选地，所述siRNA为Dkk3-281、Dkk3-419、Dkk3-937中的一种或多种。

可选地，所述步骤1中培养OC细胞的培养液含有DMEM、10％FBS与氨苄青霉素。

可选地，还包括以下步骤：将所述步骤3中的第一代成球细胞置入培养液中，用EdU染色以及毛细胞标志物抗体标记染色，并结合细胞免疫荧光观察毛细胞分化情况。

可选地，所述毛细胞标志物为Myo7a。

可选地，所述步骤1中，采用RT-qPCR技术检测所述OC细胞中Dkk3RNA表达量，并与未敲低的对照组作比较，检测每种siRNA的敲低效率。

本发明还揭示了上述任一所述的小鼠模型在研究毛细胞再生中的应用。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本申请的小鼠模型构建方法的流程图；

图2为本申请的siRNA敲低效率的对比示意图；

图3为本申请的小鼠模型的Dkk3基因敲低前后的Lgr5+细胞增殖能力对比；

图4为本申请的小鼠模型的Dkk3基因敲低前后细胞分化能力对比。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。