[发明专利]一种定量检测铁皮石斛的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，公开了一种定量检测铁皮石斛的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。所述引物的核苷酸序列如下所示5’‑ACACTTCTTGGAAACGCCGTC‑3’(SEQ ID NO.1)，5’‑CGTACAGAATACGATATCCCTC‑3’(SEQ ID NO.2)。所述探针的核苷酸序列如下所示：5’‑CCTCCCTATCGTGGGACAGACAG‑3’(SEQ ID NO.3)。采用上述特异性引物和探针能够对铁皮石斛进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种定量检测铁皮石斛的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

铁皮石斛是兰科草本植物，茎直立，圆柱形，长9-35cm，粗2-4mm，不分枝，具多节，节间长1-3-1.7cm，常在中部以上互生3-5枚叶；叶二列，纸质，长圆状披针形，长3-4cm，宽9-11mm，先端钝，基部下延为抱茎的鞘，边缘和中肋常带淡紫色；叶鞘常具紫斑，老时其上缘与茎松离而张开，并且与节留下1个环状铁青的间隙。铁皮石斛具有生津作用，主要表现为促进腺体分泌和脏器运动，还可降低链脲霉素诱发糖尿血糖值，并且能够促进荷瘤动物巨噬细胞的吞噬功能，增强T淋巴细胞的增殖和分化及NK细胞的活性，并能明显提高荷瘤动物的血清溶血素值，表明铁皮石斛无论是对非特异性免疫功能，或是特异性细胞免疫以及体液免疫功能，均有一定的提高作用。

由于该中药材价值珍贵，常常被不法分子假借其他原料来冒充，或者在铁皮石斛中掺杂其它原料。为满足检验监管工作和相关部门打假执法的需要，希望提供一种准确、方便、灵敏、可定量的铁皮石斛检测方法。

当前所用于铁皮石斛的分子生物学检测方法较少，主要为常规PCR或荧光定量PCR，常规PCR检测繁琐不便，而荧光定量PCR所用的标准曲线又会对测量结果产生影响，因此上述方法均不能满足实际的检测需要。

而数字PCR作为核酸定量的新技术，本质上将一个传统的PCR反应分成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立扩增和检测目的序列，减少了背景序列及抑制物对PCR反应的干扰，从而大大提高了检测的灵敏度。其中ddPCR(微滴式数字PCR)更是无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的定量检测，解决了荧光定量PCR所用的标准曲线对测量结果产生影响等问题。因此，本发明希望研发出一种能够更好用于检测铁皮石斛的检测方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种定量检测铁皮石斛的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法，能够对铁皮石斛进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

一种定量检测铁皮石斛的微滴式数字PCR引物，包括用于扩增铁皮石斛ITS(TPSH-ITS)基因的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如下所示：

5’-ACACTTCTTGGAAACGCCGTC-3’(SEQ ID NO.1)，

5’-CGTACAGAATACGATATCCCTC-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明基于铁皮石斛的ITS(内转录间隔区)序列进行特异性引物和探针的设计，经所述引物扩增得到的片段长度为98bp。

一种定量检测铁皮石斛的微滴式数字PCR探针，包括靶向铁皮石斛ITS基因的特异性探针，所述特异性探针的核苷酸序列如下所示：

5’-CCTCCCTATCGTGGGACAGACAG-3’(SEQ ID NO.3)。

优选的，所述探针标记有荧光基团和淬灭基团。

所述荧光基团优选为FAM、TET、HEX、CY3、JOE、VIC、ROX或CY5中的一种；所述淬灭基团优选为BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse中的一种。