[发明专利]一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，公开了一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。所述定量检测西红花的微滴式数字PCR引物的核苷酸序列为：XHH‑ITS‑F：5’‑ATAAGCGCGCCCGAGAGATGAT‑3’(SEQ ID No.1)，XHH‑ITS‑R：5’‑CATCCTGGGGTCGCATTCGAT‑3’(SEQ ID No.2)。所述定量检测西红花的微滴式数字PCR探针的核苷酸序列为：XHH‑ITS‑P：5’‑CGCCATCCATGGATTAGCGCATGGA‑3’(SEQ ID No.3)。采用上述引物和探针能够对西红花进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

西红花为著名的珍贵中药材，为鸢尾科植物番红花CrocussativusL.的干燥柱头，具有活血祛瘀，散郁开结，凉血解毒的功效，主治痛经，经闭，月经不调，产后恶露不净，腹中包块疼痛，跌扑损伤，忧郁痞闷，惊悸，温病发斑和麻疹。

由于西红花中药材价值珍贵，常常被不法分子假借其他原料来冒充，或者在西红花中掺杂其它原料。为满足检验监管工作和相关部门打假执法的需要，希望提供一种可靠的西红花检测方法。

当前所用于西红花的分子生物学检测方法较少，主要为常规PCR或荧光定量PCR，常规PCR检测繁琐不便，而荧光定量PCR所用的标准曲线又会对测量结果产生影响，因此上述方法均不能满足实际的检测需要。

而数字PCR作为核酸定量的新技术，本质上将一个传统的PCR反应分成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立扩增和检测目的序列，减少了背景序列及抑制物对PCR反应的干扰，从而大大提高了检测的灵敏度。其中ddPCR(微滴式数字PCR)更是无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的定量检测，解决了荧光定量PCR所用的标准曲线对测量结果产生影响等问题。

因此，研发出一种可更好用于检测西红花的试剂盒及方法成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物、探针、试剂盒及方法，能够对西红花进行定量检测，并具有良好的特异性和灵敏性。

一种定量检测西红花的微滴式数字PCR引物，所述引物的核苷酸序列为：

XHH-ITS-F：5’-ATAAGCGCGCCCGAGAGATGAT-3’(SEQ ID No.1)，

XHH-ITS-R：5’-CATCCTGGGGTCGCATTCGAT-3’(SEQ ID No.2)。

一种定量检测西红花的微滴式数字PCR探针，所述探针的核苷酸序列为：

XHH-ITS-P：5’-CGCCATCCATGGATTAGCGCATGGA-3’(SEQ ID No.3)。

本发明基于ITS(内转录间隔区)序列进行特异性引物和探针的设计，经所述引物扩增得到的片段长度为92bp。

优选的，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。

所述荧光基团选自FAM、TET、HEX、CY3或JOE，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。

一种定量检测西红花的试剂盒，包括上述检测西红花的微滴式数字PCR引物和检测西红花的微滴式数字PCR探针。

优选的，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物和探针，

所述检测内参基因的引物的核苷酸序列为：