[发明专利]一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法、所得灭菌质粒DNA及应用

说明书

本发明公开了一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤1：制备质粒DNA，将质粒DNA转移至离心管；步骤2：将上述离心管放入预热好的恒温金属浴中进行孵育；所述预热温度为72℃；所述孵育时间为30min以上；步骤3：孵育完成后取出离心管，快速降温冷却；步骤4：冷却完成后取出离心管，进行离心处理；步骤5：离心完成后取出离心管，离心管内为灭菌质粒DNA；能够大幅度降低蛋白表达的质粒转染过程导致的污染概率，一次性的成功转染缩短了获得目的蛋白的周期，节约了时间成本，避免了昂贵的试剂成本和人力成本的浪费。

技术领域

本发明涉及质粒DNA灭菌领域，具体涉及一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法。此外，本发明还涉及该方法制得的灭菌质粒DNA及应用。

背景技术

巴氏灭菌法，也称低温消毒法，是由法国微生物学家巴斯德发明的低温杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法，被广泛用于牛奶等食品工业中的杀菌处理，灭菌效率可达97.3%-99.9%。

目前，蛋白药物的体外表达已经成为一种趋势，尤其是用工具细胞进行蛋白药物的发现及筛选工作中，需要进行大量的体外蛋白表达工作，由此涉及到大量的细胞转染工作，成为了当今治疗性蛋白研发过程中的重要环节；由于前期筛选过程中涉及到的蛋白表达质粒数量较多、需求量不均一、批间差异等，很难保证每一个蛋白的所有质粒都能达到无菌的可直接用于转染的状态，有时候会造成不同程度的细胞污染现象，既浪费了昂贵的试剂和细胞，又使整个项目的周期受到不同程度的延迟，虽然将质粒进行过滤除菌也可以消除污染现象，但是通量一般较低，不适合进行大量的过滤除菌处理，并且需要较大的人力成本，传统的巴氏灭菌法利用细菌等微生物不是很耐热的特点，用适当的温度和时间处理，将其杀灭。

目前尚未有将巴氏灭菌法应用于质粒DNA灭菌的公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是现有的通量一般较低，不适合进行大量的过滤除菌处理，并且需要较大的人力成本，传统的巴氏灭菌法利用细菌等微生物不是很耐热，本发明提供一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，能够大幅度降低蛋白表达的质粒转染过程导致的污染概率，一次性的成功转染缩短了获得目的蛋白的周期，节约了时间成本，避免了昂贵的试剂成本和人力成本的浪费，用以解决现有技术导致的缺陷。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法制备的灭菌质粒DNA。

本发明要解决的技术问题之三是提供上述灭菌质粒DNA在细胞转染中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

在本发明的一方面，一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其中，包含以下步骤：

步骤1：制备质粒DNA，将质粒DNA转移至离心管；

步骤2：将上述离心管放入预热好的恒温金属浴中进行孵育；所述预热温度为72℃；所述孵育时间为30min以上；72℃一般为Taq DNA聚合酶在体外扩增DNA的延伸温度，在此温度下DNA可以很好的保持完整的双链形式，不会发生解链；过高的温度会导致DNA双螺旋结构的不稳定甚至解链，温度过低容易导致灭菌不彻底，造成污染；传统巴氏灭菌处理一般采取68℃左右处理30min，绝大多数细菌的致死点为68℃与时间30min以下，因为灭菌物非食品类，不必担心灭菌时间过长导致营养流失，所以本发明中所使用的时间选择为30min以上；

步骤3：孵育完成后取出离心管，快速冷却；

步骤4：冷却完成后取出离心管，进行离心；

步骤5：离心完成后取出离心管，离心管内为灭菌质粒DNA。

上述的一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其中，步骤2中，采用1.5ml加热模块将所述恒温金属浴预热至72℃。