[发明专利]一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒粒子的方法

权利要求书

1.一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法包括：

SVA繁殖：繁殖SVA，获得SVA病毒液；

SVA的间接免疫荧光鉴定：用间接免疫荧光的方法鉴定大量繁殖的SVA，确定该病毒为SVA，并初步判断SVA的含量；

三步双水相萃取方法的建立：获得纯化的SVA病毒粒子；

SVA含量的测定：测定纯化的SVA病毒粒子的含量；

蛋白印迹试验：对纯化的SVA病毒粒子进行WB验证；

SVA的电子显微镜鉴定：对纯化的病毒粒子进行电镜检测；

所述三步双水相萃取方法的建立，包括：

(1)双水相萃取体系成相盐的选择，按照双水相萃取体系的相图，选用硫酸铵、硫酸钠、磷酸钠作为成相盐并和PEG6000组成双水相萃取体系，盐和聚乙二醇的浓度分别为16％和6％，成相体系的pH值均为8.0；在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，计算病毒回收率，确定双水相萃取体系；

(2)第一步双水相萃取，在病毒悬液中加入2％的氯仿，并振荡10min；在4℃条件下，以8000rpm/min离心10min，弃沉淀，取上清，得到澄清的病毒液；在澄清病毒液中加入双水相萃取成相物质，但并不使溶液分相，用氨水将体系的pH值调整为8.0，振荡10min后，在4℃条件下，以8000rpm/min离心5min，弃沉淀，取上清，进一步澄清病毒液；所述双水相萃取成相物质为聚乙二醇和硫酸铵溶液；

(3)第二步双水相萃取，在第一步双水相萃取体系中补加聚乙二醇使其终浓度达到6％，形成硫酸铵/聚乙二醇双水相体系，并加入0.5％的氯化钠，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，使双水相体系彻底分相，病毒进入中间相和上相聚乙二醇相，并确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布；

(4)第三步双水相萃取，取出硫酸氨相，加入不同浓度的磷酸盐缓冲液，并加入0.3％的氯化钾，形成磷酸盐/聚乙二醇的双水相萃取体系，振荡混匀，后在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量。

2.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述SVA的繁殖方法，包括：

(1)将分离的SVAHN/11/2017接种于长成单层的BHK-21细胞，并在5％CO₂、37℃条件下培养；

(2)待细胞病变达到80％以上时收毒，并用间接免疫荧光的方法进行鉴定；

(3)将细胞病毒液放于-20℃以下反复冻融2次，使病毒从细胞内完全释放出来，得到病毒悬液。

3.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述SVA的间接免疫荧光鉴定，包括：

(1)将SVAHN/11/2017毒株以1MOI的量接种于生长至50％以上满的BHK-21细胞的6孔板，37℃条件下孵育8h后弃上清；

(2)经PBS漂洗3次后，用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次后用含0.2％TritonX-100的PBS通透15min，PBS洗涤3次后用含5％BSA的PBS封闭1h，PBS洗涤3次后加SVA猪阳性血清，37℃孵育1h；

(3)PBS漂洗3次后加FITC标记的羊抗猪二抗37℃孵育1h，PBS洗涤3次后置荧光显微镜下观察并拍照。

4.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布，包括：将双水相萃取体系的pH值分别调整为7.5和8.0，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布。