[发明专利]一种提高组织工程前板层角膜上皮细胞粘附力的方法

说明书

本发明属于组织工程技术领域，提供了一种能够提高组织工程前板层角膜上皮细胞粘附力的方法，包括上皮细胞扩增步骤和前板层角膜构建步骤，所述上皮细胞扩增包括前处理、消化和贴壁培养；所述前板层角膜构建包括涂布、接种和两阶培养。本发明通过将涂布液涂布到脱细胞角膜支架材料的前弹力层上，模拟人体角膜上皮细胞与前弹力层之间的基底膜，起到稳固连接上皮细胞与前弹力层的作用，另外利用气液面培养的方法，模拟人体眨眼的环境条件进行组织工程前板层角膜的构建，促进角膜上皮细胞复层化；本发明从以上两个方面保证了含有上皮细胞层的组织工程前板层角膜的临床使用效果。

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种在构建组织工程前板层角膜过程中提高角膜上皮细胞粘附力的方法。

背景技术

引起角膜盲的第二大原因是角膜病，角膜病中80％的患者可通过角膜移植来避免致盲。但是受我国角膜捐献较少，导致同种异体角膜供体匮乏，随着组织工程学的兴起，组织工程角膜材料作为解决因角膜盲病患者带来了新的希望。组织工程角膜是将天然的动物角膜作为原材料，利用脱细胞的方法去除异种角膜的外源细胞及抗原物质，从而获得异种的脱细胞角膜支架材料。

脱细胞角膜支架材料在临床使用时，对于角膜缘未受损伤的患者，可以直接接受脱细胞角膜支架材料的移植，移植后，患者的上皮细胞将以支架材料为支架基础逐渐生长扩增，直至修复(透明)，但是，对于角膜缘受损伤的患者，由于不具有上皮细胞修复功能，因此这类患者将不能直接接受脱细胞角膜支架材料的移植，必须要在体外培养制备成含有上皮细胞的组织工程角膜，再移植给角膜缘受损的患者进行治疗。所以，在脱细胞角膜支架材料上接种和培养上皮细胞形成具有上皮细胞的组织工程角膜时，接种以及体外培养上皮细胞的过程控制将直接影响组织工程角膜的临床使用效果。

在组织工程角膜的体外培养过程中，接种在脱细胞角膜支架材料上的上皮细胞与前弹力层之间的粘附力决定了组织工程角膜的临床使用效果。如果粘附力不足，上皮细胞容易脱落，从而影响使用效果，如果粘附力强，上皮细胞与脱细胞角膜支架的前弹力层结合紧密，则结构稳定，不但有利于运输和保存，而且能保证临床使用效果。

发明内容

本发明提供一种能够提高组织工程前板层角膜上皮细胞粘附力的方法，包括上皮细胞扩增步骤和前板层角膜构建步骤，所述上皮细胞扩增包括：前处理、消化和贴壁培养；所述前板层角膜构建包括：涂布、接种和两阶培养；其中，

所述前处理是指将新鲜动物角膜缘组织去除巩膜、虹膜、结膜组织和内皮层，保留上皮细胞、前弹力层和部分基质层，再用Hank液清洗以适于消化步骤；

所述消化包括用胰酶对上皮细胞和前弹性层进行消化，以使角膜上皮细胞游离；

所述贴壁培养包括将游离的角膜上皮细胞置于第一培养液中进行贴壁扩增培养；

所述涂布包括将涂布液涂布在脱细胞角膜支架材料的前弹力层上；所述涂布液为层黏连蛋白、纤维连接蛋白或胶原蛋白中的一种或多种；

所述接种包括在涂布后的角膜前弹力层上接种经贴壁培养的上皮细胞；

所述两阶培养包括将接种后的角膜前弹力层先浸没于第二培养液中进行第一阶培养，再用第二培养液进行气液面培养完成第二阶培养，制得组织工程前板层角膜。

本发明提供的提高组织工程前板层角膜上皮细胞粘附力的方法，通过将涂布液涂布到脱细胞角膜支架材料的前弹力层上，模拟人体角膜上皮细胞与前弹力层之间的基底膜，起到稳固连接上皮细胞与前弹力层的作用，提高了组织工程前板层角膜上皮细胞的粘附力；另外，本发明提供的提高组织工程前板层角膜上皮细胞粘附力的方法，先浸没培养使细胞黏附生长，再利用气液面交替培养的方法，模拟人体眨眼的环境条件进行组织工程前板层角膜的构建，促进角膜上皮细胞复层化；本发明从以上两个方面保证了含有上皮细胞层的组织工程前板层角膜的临床使用效果。