[发明专利]一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，旨在提供一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用。是将目的抗原SP‑E2和自组装分子的基因通过杆状病毒表达系统融合表达，形成SP‑E2‑mi3融合蛋白；然后进一步通过纳米组装，形成自组装蛋白纳米颗粒；所述目的抗原SP‑E2和自组装分子的基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过自组装分子基因融合CSFV E2，通过杆状病毒表达系统表达和纯化得到的融合蛋白，在体外可组装成SP‑E2‑mi3纳米颗粒。本发明用于疫苗制备时，较常规的亚单位疫苗免疫原性强，可通过鉴别诊断能够区分感染及免疫动物，能够从根本上净化猪瘟病毒。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医学技术领域，涉及自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，以及基因工程化的嵌合纳米颗粒在疫苗领域的应用。

背景技术

基于灭活的或减毒的病原体控制传染病的传统疫苗，其特点是具有有效的T细胞、B细胞反应和记忆免疫。尽管它们可以在宿主中诱导有效的免疫效力，但随着近来重要流行病的出现，对安全有效的疫苗策略的需求和关注日益增加。因此，考虑到与传统疫苗策略相比的优势，包括不存在完整病原体的致病因子，易于生产、生物安全和DIVA问题(受感染动物和接种疫苗的动物之间的区别)，基因工程亚单位疫苗已变得越来越流行。

通常，疫苗的免疫原性在很大程度上受到抗原的理化特性的影响。为了提高疫苗的免疫原性，具有出色免疫原性的经典灭活或减毒病原体可以提供关键参考，包括1)减毒病原体的复制能力2)高度重复和有序的表面抗原阵列3)微粒抗原的性质4)同时激活先天和适应性免疫的能力。基于这些发现，已提出了多种方法来增强亚基疫苗的免疫原性，其中包括通过与大型蛋白质载体或佐剂偶联来增加抗原大小，抗原多聚化以及在颗粒载体上表面高度重复的抗原表面展示。

具有生物活性的蛋白质分子相互作用并自我排列，形成与其自然状态下的功能密切相关的有序结构。这是自组织形成纳米颗粒的能力，在自组装蛋白纳米颗粒(SAPNs)中得到了很好的证明。SAPN通常由各种高度重复的基序组成，可以利用这些基元将外来抗原决定基或蛋白质整合到其结构中，因此可以将这些嵌入的分子表面展示在组装的颗粒上。这些嵌合的SAPN是在生物医学领域中抗原表位和蛋白质递送的理想载体。SAPN上外来抗原的空间排列类似于天然病原体上的病原体相关分子模式(PAMP)，其特征在于高抗原密度和高度有序的结构，从而增强了抗原与BCR之间的交联反应。这种多重相互作用与刺激有效免疫反应的关键步骤密切相关，并且它还为提高亚基疫苗的免疫原性提供了另一种解决方案。

对于疫苗递送，基于纳米粒子(NPs)的疫苗在引发适应性和先天免疫性方面，具有优于亚基可溶性抗原的许多改进特性。纳米级的颗粒可以改善抗原的吞噬作用，并通过抗原呈递细胞(APC)内在化。树突状细胞(DCs)作为最强大的APC，在启动有效的免疫反应中起关键作用，并且倾向于通过内吞作用内化纳米颗粒抗原，而不是可溶性抗原。与通常通过II类MHC途径呈递的可溶性蛋白抗原不同，NPs抗原内化到APC中可通过II类MHC和I类MHC途径促进交叉呈递和交叉启动，随后增强CD8⁺CTL免疫应答。而且，NP本身也作为递送系统发挥辅助作用。除了增强抗原内在化和呈递作用外，NP还可以促进先天免疫的激活，免疫刺激性细胞因子的分泌以及DC的成熟和迁移，这反过来又促进了免疫反应的初始化。

病毒样粒子(VLPs)是一种自组装的NP，已经在针对多种疾病的疫苗开发中取得了巨大成功，例如，基于许可的商用VLP疫苗，包括针对乙型肝炎，宫颈癌和戊型肝炎的疫苗，就是例证。疫苗在临床试验阶段针对不同的感染进行了评估。这些结果表明，基于NP的递送技术可增强适应性免疫和先天性免疫，从而产生强大的保护性免疫。