[发明专利]重组乙型肝炎疫苗中β-内酰胺类抗生素的检测方法

说明书

本发明提供一种重组乙型肝炎疫苗中β‑内酰胺类抗生素的检测方法，本发明采用液相色谱‑质谱联用仪，首次建立同时检测重组乙型肝炎疫苗中40种β‑内酰胺类抗生素的方法。本方法实现了残留抗生素高通量筛查，具有高速、准确，灵敏度高，操作时间短的特点，同时采用MRM的扫描方式，减少了假阳性的产生。疫苗中40种β‑内酰胺类抗生素同时定性定量分析，也为检测疫苗中其他抗生素残留方法的建立提供了新的思路，为保证疫苗中的质量提供了保障。同时对不同疫苗研制阶段中抗生素残留的检测，可掌握不同阶段下抗生素残留量，及时做出调整，避免因终产品不合格而导致的巨大损失。

技术领域

本发明涉及疫苗中抗生素残留检测，具体地说，涉及一种重组乙型肝炎疫苗中β-内酰胺类抗生素的检测方法。

背景技术

疫苗作为生物制品中一种预防类产品，主要是通过将病原微生物(如细菌、病毒、螺次体等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或采用基因工程等方法制成。在生产和存储的过程中，为了保证产品的质量，常加入一些抗生素抑制细菌、衣原体、支原体的感染，造成抗生素残留，从而导致一些不良反应。人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)将疫苗中抗生素的残留作为工艺杂质进行控制；美国药典、欧洲药典、中国药典等均要求对疫苗中抗生素的使用进行限制。

β-内酰胺类抗生素是比较常见的一类抗生素，主要是通过抑制细菌细胞壁的合成来达到抑菌的效果，抗菌率高，可对G+菌、G-菌起作用。过敏反应是其最常见的不良反应，该反应通常与使用剂量无关，对于比较敏感的人群，极微量都可能导致休克或死亡，同时各种青霉素之间也存在交叉过敏，对于青霉素过敏的患者，可能对于其他β-内酰胺类抗生素也产生过敏反应。因此，不管是中国药典还是美国药典都规定疫苗中不能添加β-内酰胺类抗生素。

控制疫苗中抗生素残留对保障消费者安全尤为重要。在《中国药典》附录中对于抗生素残留检测方法，采用培养法，但是该方法在检测复杂成分的生物制品中容易受干扰。对于多数疫苗项下的抗生素残留检测采用酶联免疫反应的方法。该方法是采用对应的试剂盒，进行抗原抗体结合，每检测一种抗生素就要对应一种试剂盒，一次检测只能对一种或是一类抗生素进行检测，无法实现抗生素高通量检测。姜崴(2010)采用间接竞争ELISA方法检测了疫苗中卡那霉素残留量采用了一种试剂盒。在测定流感疫苗生产用鸡胚中氨苄青霉素和氯霉素的残留时，就采用了相应的两种试剂盒进行测定。

近些年随着仪器分析的发展，检测结果准确、分离速度快、分离效率高，越来越广泛的应用于环境、食品、生物、医药领域。目前，液质联用技术是化合物分析中常用的检测手段，既具备分子结构分析的能力，也可实现一次扫描筛查多种化合物，在抗生素的滥用和残留检测中广泛应用。但目前关于疫苗中多种β-内酰胺类抗生素的检测方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)中β-内酰胺类抗生素的检测方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)中β-内酰胺类抗生素的检测方法，包括：

A、配制不同浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液；其中，β-内酰胺类抗生素选自法罗培南、头孢羟氨苄、苯唑西林、头孢克肟、头孢吡肟、拉氧头孢、头孢地嗪、青霉素、阿莫西林、头孢噻吩、氟氯西林、头孢甲肟、头孢替安、头孢匹胺、头孢氨苄、头孢克洛、头孢唑啉、头孢他美酯、头孢呋辛酯、头孢哌酮、头孢拉定、头孢唑肟、氯唑西林、头孢噻肟、头孢匹罗、美洛西林、头孢西丁、氨苄西林、美罗培南、阿洛西林、哌拉西林、头孢他定、头孢泊肟酯、青霉素V、替卡西林、头孢呋辛、头孢美唑、头孢硫脒、比阿培南和头孢丙烯中的两种或两种以上；

B、向重组乙型肝炎疫苗空白基质中分别加入上述不同浓度的β-内酰胺类抗生素混合标准溶液，混匀，制成系列浓度的加标样品溶液，然后进行液相色谱串联质谱检测；

其中，所述重组乙型肝炎疫苗空白基质是指不含β-内酰胺类抗生素的重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)；