[发明专利]一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用，属于生物发酵技术领域。其中，α‑法尼烯合成酶FSCS的氨基酸序列用SEQ ID No.1所示。本发明构建了含有该基因的重组表达载体，建立了生物合成法尼烯的方法。本发明对一种此前未明确报道过的萜类合成酶进行了功能表征，并进行了酶学性质的初步研究，在酶学性质的指导下改变发酵条件，实现了法尼烯在酿酒酵母中的生物合成，相较于已报道的苹果来源法尼烯合成酶有更好的表达效果，有利于指导法尼烯在微生物中的高效生产。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，尤其是涉及一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。

背景技术

α-法尼烯(Farnesene)化学名为3,7,11-三甲基-1,3,6,10-十二碳四烯，分子式为C15H24，由三个异戊二烯单元构成，相对分子量为204。法尼烯属于倍半萜化合物，不溶于水，与十二烷、乙酸乙酯、正己烷等有机溶剂混溶。自然界中法尼烯有两种光学异构体，α-法尼烯和β-法尼烯。法尼烯与苹果虎皮病的发生有关，也是一种信息素，能够诱导昆虫捕食蚜虫等，在植物防御方面有广泛研究价值。此外，法尼烯可作为高效燃料的替代物，并且在香水领域也具有应用前景。

法尼烯存在于多种植物的叶片和果实中，在自然界中含量极低。目前主要通过原材料提取法、化学合成法以及微生物合成法获取法尼烯，原材料提取法稳定性差，且受季节变化影响大；化学合成法手段复杂，毒性和成本高。近年来随着合成生物学和代谢工程技术的快速发展，构建微生物细胞工厂成为萜类化合物高效合成的有效手段。

微生物细胞合成法尼烯需要引入外源法尼烯合成酶，通过催化底物法尼基焦磷酸生成法尼烯。目前，法尼烯在微生物中的合成主要通过代谢工程手段对法尼烯合成途径中关键位点进行调控，增强前体物质供应，从而提升法尼烯产量。法尼烯合成酶作为法尼烯合成途径中的关键酶，对法尼烯的合成有重要作用。因此选择高表达效率的法尼烯合成酶，对于法尼烯在微生物中的高效生产有重要意义。

发明内容

本申请为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种甜橙来源萜类合成酶FSCS，并将其与一种苹果来源法尼烯合成酶FSAP通过BLAST进行氨基酸序列同源性比对，发现两者序列相似度为56.36％的。其中，FSAP氨基酸序列用SEQ ID No.3所示，核苷酸序列用SEQID No.4所示。本发明对甜橙来源萜类合成酶FSCS进行了功能表征以及酶学性质研究，并且本发明提供了FSCS在酿酒酵母合成法尼烯中的应用，并在酶学性质的指导下探究了不同发酵条件对法尼烯合成的影响。本发明得到的α-法尼烯合成酶FSCS生产α-法尼烯产量高，酶活较好。

本发明的技术方案如下：

一种α-法尼烯合成酶FSCS基因，所述α-法尼烯合成酶FSCS基因的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，编码得到所述α-法尼烯合成酶FSCS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种表达载体，所述的α-法尼烯合成酶FSCS基因。

一种重组酿酒酵母菌株，所述重组酿酒酵母菌株包含所述的α-法尼烯合成酶FSCS基因。

一种重组酿酒酵母菌株的制备方法，所述重组酿酒酵母菌株的构建方法包括如下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的α-法尼烯合成酶FSCS基因克隆入表达载体中得到重组表达载体质粒Ts gal80-xtpfscs，将所述重组质粒转化入宿主细胞酿酒酵母菌中。

一种重组酿酒酵母菌株的用途，所述重组酿酒酵母菌株在酿酒酵母中发酵生产α-法尼烯中的应用。

进一步的，所述生产α-法尼烯的发酵培养基为：10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，30g/L的葡萄糖，10％(V/V)十二烷，发酵条件为：菌体对数生长期内发酵时间为24-30h，温度为30℃，待葡萄糖消耗完毕后变为20℃进行后续发酵；发酵时间为24-96h。