[发明专利]一种非特异性过氧合酶的重组菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开一种非特异性过氧合酶的重组菌株及其构建方法和应用，属于酶工程应用领域。所述重组菌株以pPICZαA质粒为出发载体，以毕赤酵母作为宿主菌，表达非特异性过氧合酶GmaUPO；所述非特异性过氧合酶GmaUPO的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过基因工程技术，成功在毕赤酵母中异源表达了GmaUPO，并优化了发酵条件，进行了重组酶的催化应用的初步研究，旨在扩大UPO生物酶的资源库，以替代现有的化学法进行芳香烃的高效清洁生产，同时为其催化应用提供一定的研究基础。

技术领域

本发明属于酶工程应用领域，具体涉及一种非特异性过氧合酶的重组菌株及其构建方法和应用。

背景技术

非特异性过氧合酶(Unspecific peroxygenase，UPO，EC 1.11.2.1)是一类可利用H₂O₂实现C-H键催化氧化官能化的血红素氧化酶，因具有多功能氧化催化活性，使其成为了近年来的研究热点，在催化C-H键的羟基化、C＝C键的环氧化和硫醚类物质的磺化等不同类型的反应中，产物的区域选择性和立体选择性被认为是有机化合物氧化功能化的新一代生物催化剂。具有同样功能的P450单加氧酶，其催化过程中需要烟酰辅酶因子NAD(P)H作为电子供体，同时伴有辅因子再生系统，其复杂的电子传递链使得反应难以广泛应用。而UPO能够直接利用H₂O₂作为氧供体和电子受体，因而具有更高的实际应用价值。

真菌来源的血红素氧化酶实现异源高效表达一直以来都是制约上述研究的瓶颈。选择适合的表达系统用于该类酶基因的重组表达十分关键。目前已经报道可以异源表达UPO的表达系统包括毕赤酵母、酿酒酵母、米曲霉、及大肠杆菌等。大肠杆菌表达系统表达易形成包涵体，虽然可通过体外活化的方式进行变复性，但针对UPO包涵体变复性的方案尚未有报道。另外，由于含血红素的酶在异源宿主胞内分泌不足，合成效率过低，直接影响血红素与新生重组蛋白的结合，往往导致重组酶的痕量表达，严重制约该类酶在生物转化产业上应用。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种非特异性过氧合酶的重组菌株。

本发明的另一目的在于提供上述非特异性过氧合酶的重组菌株的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述非特异性过氧合酶的重组菌株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种非特异性过氧合酶的重组菌株，所述重组菌株以pPICZαA质粒为出发载体，以毕赤酵母作为宿主菌，表达非特异性过氧合酶；所述非特异性过氧合酶(GmaUPO)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述非特异性过氧合酶(GmaUPO)的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

非特异性过氧合酶目的基因和原始信号肽片段融合成融合基因连接到pPICZαA质粒的EcoR I和SalI位点之间，然后电转化到毕赤酵母中进行表达。

优选的，原始信号肽(SP_Gma)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，原始信号肽(SP_Gma)的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X-33。

非特异性过氧合酶重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

1)以pPICZαA为模板，以上游引物F1和下游引物R1为引物，扩增得到含有EcoRI和SalI酶切位点的质粒pPICZαA；

上游引物F1：5’-ATCCCAACACTCGAGGCCCGAGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTT-3’；

下游引物R1：5’-GAACAGGGGAAAATATTTCATGAATTCCTCGTTTCGAATAAT-3’；