[发明专利]一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法

说明书

本发明公开了一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，包括免疫细胞CIK的分离、细胞CIK的无血清体外扩增、分析细胞CIK的生长曲线、分析细胞CIK表面抗原表达、分析细胞CIK周期、免疫细胞CIK的冻存及复苏、免疫细胞各项指标检测。无血清培养基悬浮培养体系，分离获得的免疫细胞CIK具有增殖能力，利用细胞冻存液1冻存的细胞复苏后，细胞活性在四种细胞冻存液中的细胞活性最高，在90%以上，流式细胞仪检测结果表明，冻存前的细胞与冻存复苏后的细胞的免疫表型无明显差异，均具有免疫细胞的免疫表型，流式细胞术检测细胞凋亡实验表明，细胞冻存液1冻存的细胞复苏后，晚期凋亡的细胞数最少，且未发生凋亡的细胞数最多。

技术领域

本发明涉及一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，具体为一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，属于细胞研究技术领域。

背景技术

血液系统恶性肿瘤的发病率逐年升高，其死亡率在国内外肿瘤排名中处于前十位，传统疗法(如放疗、化疗、手术、造血干细胞移植等)能使部分患者生存获益，但复发、难治、耐药等现象仍是目前面临的巨大挑战。近年来，随着分子生物学、免疫学等先进技术的发展，细胞免疫治疗已成为包括恶性血液病在内的多种肿瘤治疗的重要手段，被 Science杂志列为 2013 年十大科学突破之首。脐血又称胎盘血或脐带血。脐血来源丰富、采集简单，具有配型要求低、免疫排斥发病率低、移植费用低和移植成功率高等优点，已被广泛地应用于白血病及非恶性血液病、先天性免疫缺陷等多种疾病治疗，因此脐血已成为继骨髓和外周血后的第三大造血干细胞的来源。随着脐血来源造血干细胞的应用，其产生的储存问题已经成为热点。因此，评价不同冻存液冻存脐血来源单个核细胞的效果，对建立安全稳定的脐血库至关重要，是当前刻不容缓的问题。

CIK细胞具有强大的杀瘤活性，具有TIL、LAK细胞所无法比拟的优势，但诱导CIK细胞需要发费很长的时间，在临床应用上需要多次诱导和采血，给患者造成了极大的痛苦和不必要的麻烦。也有人提出将对数期生长的CIK细胞像其他传代细胞一样低温保存，需要时再复苏，但是现有的技术使得复苏的细胞活性偏低，达不到我们高效增殖的目的。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决问题而提供一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种免疫细胞CIK的冻存液及其活性研究方法，包括以下步骤：

步骤一、免疫细胞CIK的分离包括以下过程：

（1）、在生物安全柜中，将外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml，平分至50ml离心管中，设定离心参数升9降7，2000rmp，离心8min；

（2）、外周血离心后先吸取上层血浆至50ml离心管中，取四个EP管，每管加入1.0ml血浆，水浴锅中56℃灭活30min，3000rpm离心10min，取上层血浆至洁净50ml离心管中，备用；

（3）、用NA稀释血细胞，使得血细胞：NA为1:1。

步骤二、细胞CIK的无血清体外扩增包括以下步骤：

（1）、免疫细胞的起始培养；

离心收集全部细胞，用30ml CIK培养液（里面添加自体血清1.5ml，5%）重悬，及加2mlCIK扩增试剂，设定离心参数，升9降7，2000rpm，离心8min，倒弃剩余上清。用电动助吸器吸取15mlCIK细胞培养液至离心管中，悬浮沉淀，吹打混匀后加入培养瓶中，加CIK细胞培养液15ml离心管并转入培养瓶中，水平放置在37℃、7.5%的CO2培养箱中培养。

（2）免疫细胞的无血清培养；