[发明专利]一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法

权利要求书

1.一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、人MSCs体外诱导为胰岛样细胞团，取传代至第3代的人MSCs，待细胞融合至70%-80%后，换用含10ug/L碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基进行诱导分化；

步骤二、双硫腙染色，取双硫腙粉末10mg溶于1mL二甲基亚砜中，配成储备液，-20℃保存备用；

步骤三、大鼠糖尿病模型的制备，包括以下过程：

（1）、将0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液将链脲佐菌素制成2%注射液，待大鼠空腹12h后，经腹腔注射70mg/Kg链脲佐菌素和0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液；

（2）、大鼠分别于注射前、注射后48h、5d、8d空腹断尾采血，测定全血血糖浓度；

（3）、大鼠血糖浓度正常值为2.80-7.56mmol/L，选用连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。

步骤四、胰岛样细胞团的移植，造模后，胰岛样细胞组大鼠于肾被膜下移植入胰岛样细胞2*106个，间充质干细胞组大鼠于肾被膜下移植入未诱导的脐带间充质干细胞2*106个，模型对照组大鼠于肾被膜下移植不含任何细胞的培养液1mL，各组大鼠均于移植前及移植后48h测定空腹血糖浓度，之后每周定点测空腹血糖及体质量1次；

步骤五、胰腺组织免疫组化检测，胰腺取出后，迅速放入甲醛溶液中，固定3h后常规免疫组化法染色，酶修复30min，加羊抗鼠一抗过夜，次日二康修复；

步骤六、统计学方法分析。

2.根据权利要求1所述的一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步骤一中，诱导前，MSCs呈长梭形，贴壁生长。诱导4d后，细胞向中央聚集，同时出现胰岛样细胞团。诱导7d的胰岛样细胞团经双硫腙染色15min后，倒置显微镜下可见细胞团多数细胞着色，呈现棕红色阳性表达，周边有少数细胞不着色。

3.根据权利要求1所述的一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步骤二中，双硫腙临用时用PBS缓冲液1：100稀释，0.22μm孔径滤膜过滤。于倒置显微镜下加入到随机挑选的诱导后的胰岛样细胞团，置37℃孵育箱中孵育15min，PBS洗3次，镜检。

4.根据权利要求1所述的一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步骤三中，造模前各组大鼠空腹血糖浓度均处于正常范围内。腹腔注射链脲菌素48h后，大鼠血糖浓度迅速升高。注射后第5天和第8天，大鼠血糖浓度均大于16.7mmol/L，证明建模成功。

5.根据权利要求1所述的一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步骤四中，胰岛团细胞移植后2周，胰岛样细胞组大鼠血糖浓度明显降低，且胰岛素分泌增加，一直维持至第6周。间充质干细胞组大鼠血糖浓度在移植后有所下降，胰岛素分泌有所增加，至移植后第4周胰岛素分泌减少，之后维持较低水平。正常对照组一直处于糖尿病血糖状态，且无胰岛素分泌。

6.根据权利要求1所述的一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步骤五中，在进行胰腺组织免疫组化检测时，利用苏木精复染，SABC试剂盒显色。

7.根据权利要求1所述的一种自体MSCs体内胰岛归巢分化治疗糖尿病的研究方法，其特征在于：所述步骤六中，采用SPSS软件进行统计学分析。