[发明专利]一种有机磷水解酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种有机磷水解酶突变体及其应用，属于基因工程和生物酶学技术领域。所述突变体为有机磷水解酶的第257位的组氨酸突变为酪氨酸，第303位的亮氨酸突变为苏氨酸，所述有机磷水解酶突变体的氨基酸序列如SEQNO.1所示。所述突变体有效增强了有机磷水解酶的活性和水解底物的能力，所述突变体用于降解对氧磷类化合物时，有效提高了对氧磷类化合物的水解速率。

技术领域

本发明涉及一种有机磷水解酶突变体及其应用，属于基因工程和生物酶学技术领域。

背景技术

生物酶作为生物催化剂，能够特异性地加快一系列生物化学反应速度。其中有机磷水解酶(Organophosphorus hydrolase，OPH)用于生物降解有机磷毒剂，对神经性毒剂的洗消、保障人体健康和保护生态环境具有重大意义。有机磷水解酶(OPH)是典型的磷酸三酯酶，它通过水解磷原子和亲电原子解离基团酯键的各种磷酸键(P-O键、P-CN键、P-F键和P-S键)，从而水解许多有机磷酸三酯、硫酯、氟磷酯。

有机磷毒剂如沙林(GB，sarin)中含有典型的对氧磷结构，OPH催化对氧磷水解的机制提示水分子在金属中心被活化为桥连氢氧根，后者进攻底物的中心磷原子，催化起始步骤与离去基团没有关系。具体的反应历程可分为四个阶段：①OPH金属中心的Zn²⁺去质子化一个水分子，产生的桥连氢氧根与双核Zn²⁺和第301位的天冬氨酸(D301)配位连接；②底物结合到酶的活性部位，桥连氢氧根亲核进攻底物分子中的磷原子，同时D301获得氢氧根上的H质子；③β-Zn²⁺极化磷酰基氧，导致β-Zn²⁺与氢氧根的结合减弱，磷中心推电子效应增强；底物P-O键断裂，释放离去基团(即第一个产物对硝基酚)，形成酶与第二个产物的复合物，酶-产物复合物由金属Zn²⁺中心稳定；④质子通过D301迁移到H254并远离酶的活性位点；释放第二个产物，活性空腔恢复原始状态，进入下一轮催化。由于自身性质所限，野生菌OPH降解有机磷化合物活性不能满足各种情况下快高效、快速降解有机磷化合物的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种有机磷水解酶突变体及其应用，OPH中第257位的组氨酸突变为酪氨酸(H257Y)且第303位的亮氨酸突变为苏氨酸(L303T)后有效增强了OPH的活性和水解底物的能力，所述突变体用于降解对氧磷类化合物时，有效提高了对氧磷类化合物的水解速率。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

一种有机磷水解酶突变体，所述突变体为有机磷水解酶的第257位的组氨酸突变为酪氨酸，第303位的亮氨酸突变为苏氨酸。

进一步的，所述有机磷水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

进一步的，编码所述有机磷水解酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

一种有机磷水解酶突变体的应用，所述有机磷水解酶突变体作为降解对氧磷类化合物的生物酶使用。

进一步的，所述对氧磷类化合物为沙林。

有益效果

1、与野生型OPH相比，H257Y与L303T同时突变后的有机磷水解酶降解对氧磷类化合物的速率明显提升。

2、突变后的有机磷水解酶可以更好的促进沙林的水解，降解沙林的速率从0.452mg/(min·mg)上升至0.879mg/(min·mg)，使得该酶在生化洗消、环境保护等领域的实际使用具有更广阔的前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例中若无特殊说明均为本领域常规操作。

实施例1

有机磷水解酶点突变和分泌表达