[发明专利]一种在里氏木霉中高产木聚糖酶的方法及其应用

权利要求书

1.一株重组里氏木霉，其特征在于，以里氏木霉RUT-C30Δura3为宿主，以PgpdA启动子表达了转录激活因子XYR1，并以改造后的人工Pcbh1启动子表达了木聚糖酶XYNII；

编码所述转录激活因子XYR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

所述PgpdA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

所述改造后的人工Pcbh1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

编码所述木聚糖酶XYNII的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述里氏木霉RUT-C30Δura3是以里氏木霉RUT-C30为亲本敲除ura3基因构建成尿嘧啶营养缺陷型。

2.权利要求1所述的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，将XYR1基因与XYNII的基因分别连接到骨架质粒上，将重组质粒转化农杆菌AGL1，并将里氏木霉RUT-C30Δura3与含有相应质粒的农杆菌共培养转化，得到重组里氏木霉。

3.根据权利要求2所述的重组里氏木霉的构建方法，其特征在于，

（1）克隆PgpdA启动子与XYR1的编码框架以及ace1上下游片段，通过同源重组构建XYR1表达载体pXYR1；

（2）将重组质粒pXYR1转化农杆菌，挑取转化子与里氏木霉RUT-C30Δura3共培养转化，得到单交换到ace1位点的转化子C30OExyr1；

（3）将cbh1的同源臂上游、潮霉素筛选标记HYG表达框、7IRPcbh1启动子、XYNII的序列、cbh1终止子序列通过InFusion连接到经过改造的pCAMBIA1301G，构建成载体p7IRCbhxyn2Δcbh1；所述经过改造的pCAMBIA1301G，是以pCAMBIA1301G为模板，用引物扩增载体，并从里氏木霉基因组上分别扩增启动子Ppki、ura3的CDS区域、终止子Tcbh2以及反筛重叠区域，然后将以上5个片段通过Infusion连接，得到经过改造的pCAMBIA1301G；

（4）将重组质粒p7IRCbhxyn2Δcbh1转化农杆菌，与里氏木霉C30OExyr1进行共培养转化，经潮霉素筛选得到定点整合cbh1位点的转化子C30OExyr1/7IRxyn2Δcbh1。

4.利用权利要求1所述的重组里氏木霉生产木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养重组里氏木霉，使之生孢；收集孢子，接到SDB培养基培养，然后转接到纤维素诱导发酵培养基、乳糖发酵培养基或葡萄糖发酵培养基，于28 ˚C 200 rpm培养4-5天，培养过程中重组里氏木霉表达木聚糖酶活力与木糖苷酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纤维素诱导发酵培养基的配方是：20g/L 麸皮；30 g/L微晶纤维素；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl₂；0.6 g/LMgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/L CoCl₂，pH 5.5。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述乳糖发酵培养基的配方是：50 g/L 乳糖；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl₂；0.6 g/L MgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/L CoCl₂，pH 5.5；

所述葡萄糖发酵培养基的配方是：50 g/L葡萄糖；4 g/L KH₂PO₄；2.8 g/L (NH₄)₂SO₄；0.5 g/L CaCl₂；0.6 g/L MgSO₄；3 g/L蛋白胨；0.6 g/L 尿素；1 g/L吐温80；5 g/L碳酸钙；0.005 g/L FeSO₄·7H₂O；0.0016 g/L MnSO₄·H₂O；0.0014 g/L ZnSO₄·7H₂O；0.002 g/LCoCl₂，pH 5.5。