[发明专利]一种突变酶CYP153A M228L及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用

权利要求书

1.一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建优化后重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、优化后重组质粒pET21b-CYP153A M228L-CPR_BM3、优化后重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI；

CYP153A M228L-CPR_BM3融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；脂酰CoA合成酶基因MaMACS的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；脂酰CoA脱氢酶基因PpFadE的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ctYdiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

（2）利用步骤（1）制得的重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、pET28a-SUMO-ctYdiI转化到大肠杆菌基因缺失菌BL21 ΔFadB、R、J，构建大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、J，pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、pET28a-SUMO-ctYdiI，将重组质粒pET21b-CYP153A M228L-CPR_BM3转化到大肠杆菌BL21中，构建大肠杆菌BL21 pET21b-CYP153A M228L-CPR_BM3，两种工程菌经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；

所述大肠杆菌基因缺失菌BL21 ΔFadB、R、J为大肠杆菌BL21 中敲除了FadB基因、FadR基因和FadJ基因得到；

（3）将步骤（2）制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、J，pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、pET28a-SUMO-ctYdiI静息细胞中加入癸酸培养制得反式-2-癸烯酸；将反应液中加入大肠杆菌BL21 pET21b-CYP153A M228L -CPR_BM3静息细胞，培养制得10-羟基-2-癸烯酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建优化后的重组质粒pET21b-CYP153A M228L-CPR_BM3，包括如下步骤：

构建重组质粒pET21b-CYP153A-CPR_BM3，包括如下步骤：

以经过密码子优化的海杆菌Marinobacter aquaeolei 的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) P450 NADH还原酶CPR_BM3的融合酶基因为模板进行PCR扩增，CYP153A的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，CPR_BM3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，然后将pET21b质粒用Nde I和Xho I进行双酶切，经多片段无缝克隆试剂盒连接，制得重组质粒pET21b-CYP153A-CPR_BM3；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸CYP153A 45S、CPR_BM3 55S ，循环30次；72℃延伸5min；

以构建好的质粒pET21b-CYP153A-CPR_BM3基因为模板进行反向PCR扩增，CYP153AM228L-CPR_BM3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，然后利用Dpn I酶去除原始模板；然后利用Dpn I酶去除原始模板后，转化到感受态细胞Escherichia coli BL21中使其环化，得到重组质粒pET21b- CYP153A M228L-CPR_BM3。