[发明专利]一种提取乳鼠肾原代细胞的方法

权利要求书

1.一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将乳鼠采用颈椎脱臼处死，在无菌间内用75％酒精浸泡消毒乳鼠体表3-5min,然后在细胞操作台中，将乳鼠背部皮肤剪出一工字型开口，然后皮肤拉开并固定使腰背部肌肉暴露出来，用75％酒精消毒乳鼠背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪；

(2)将肾脏剪成数块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，先加入含胰酶的第一消化液，消化处理8-12min,然后再加入含胶原酶的第二消化液，消化处理15-20min,然后过滤去除未消化组织及肾小球，得悬液；

(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min,然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用，然后再次离心处理，加入PBS进行洗涤，随后离心，去除上清后，加入细胞完全培养基进行重悬，将细胞悬液转移至1029Corning培养皿中，于细胞培养箱贴壁30-45min,使巨噬细胞贴壁去除；

(4)将1029Corning培养皿中的培养基吸入到3003Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度，即得乳鼠肾原代细胞。

2.根据权利要求1所述的一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中乳鼠为三日龄乳鼠。

3.根据权利要求1所述的一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中第一消化液为0.05％胰酶-EDTA溶液，第二消化液为0.2％胶原酶IV溶液。

4.根据权利要求1所述的一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中第一次消化处理和第二次消化处理的环境温度均为37℃。

5.根据权利要求1所述的一种提取乳乳鼠肾原代细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中第一消化液和第二消化液的用量均按照乳鼠2颗肾/0.5-1mL的量加入。

6.根据权利要求1所述的一种提取乳乳鼠肾原代细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中第一次消化和第二次消化均每3min吹打一次使消化更均匀。

7.根据权利要求1至6任一项所述的一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中肾脏首先剪成4-6块，PBS洗涤后再剪碎成大小为1mm³以内的细碎组织。

8.根据权利要求7所述的一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其特征在于，所述细胞完全培养基由以下各原理混配而成：DMEM(1X)培养基、2％双抗和15％灭活胎牛血清。