[发明专利]检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法

权利要求书

1.检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步、动物免疫及筛选方法的建立，包括动物免疫、细胞筛选条件的优化和效价检验；

第二步、杂交瘤细胞株的制备，包括骨髓瘤细胞的准备、饲养细胞的准备、脾细胞的准备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆化培养；

第三步、杂交瘤细胞的扩大培养及冻存；

第四步、单克隆抗体的批量制备；

第五步、单克隆抗体的纯化；

第六步、单克隆抗体的鉴定，包括腹水及抗体效价测定、抗体亚类鉴定、抗体配对实验。

2.根据权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，动物免疫及筛选方法的建立包括如下步骤：

步骤S11、动物免疫：取人工合成偶联载体蛋白的p-tau-181多肽和未磷酸化tau重组蛋白加入等量弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，50μg/只的剂量分别免疫Balb/c小鼠，背部皮下多点注射；第3周进行第二次免疫，取人工合成偶联载体蛋白的p-tau-181多肽和未磷酸化tau重组蛋白加入等量弗氏不完全佐剂混匀，充分乳化，25μg/只免疫Balb/c小鼠，背部皮下多点注射；每次免疫间隔2周，最后一次无佐剂完全抗原腹腔注射加强免疫一次；

步骤S12、细胞筛选条件的优化：采用间接ELISA检测法，以p-tau-181多肽和tau重组蛋白过量包被1.0μg/mL聚苯乙烯反应板，辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，梯度稀释酶标二抗，确定酶最佳工作浓度，然后以最佳酶稀释度进行测定；

步骤S13、效价检验：用建立的间接ELISA方法测定免疫小鼠的血清抗体效价；选取效价最高的免疫小鼠，腹腔注射加强免疫一次，三日后摘取小鼠脾脏进行细胞融合。

3.根据权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，杂交瘤细胞株的制备，包括如下步骤：

步骤S21、骨髓瘤细胞的准备：

于融合前两周复苏骨髓瘤细胞：将冻存管自液氮中取出，立即放到37℃温水中，用DMEM培养液轻轻混悬，混匀后加入细胞培养瓶中，置37℃、含5％CO₂培养箱中进行传代培养；培养过程中在培养液中加入8-氮鸟嘌呤，每日处理1次，连续处理3次，传至8瓶，并使融合当日的骨髓瘤细胞处于对数生长期，备用；

步骤S22、饲养细胞的准备：

细胞融合当日准备饲养细胞：取一只12-16周龄健康Balb/c小鼠，摘眼球取血，制备阴性血清；断颈处死，用体积分数75％的酒精消毒处理；将小鼠置于超净工作台中，腹面向上，用镊子提起小鼠腹部皮肤，在下腹部剪一小口，纵向剥离，充分暴露腹膜，并用酒精消毒；用一次性灭菌注射器抽取5mL的HAT培养液注入小鼠腹腔内，右手注射器保持不动，轻摇小鼠，随后抽取细胞悬液；将细胞悬液加入60mL的HAT培养基中，混匀后计数，调整细胞浓度至1×10⁵-5×10⁵个/mL；按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养备用；

步骤S23、脾细胞的准备：

选取ELISA检测效价最高的免疫小鼠，腹腔注射追加免疫一次，三日后对该鼠摘眼球取血，制备阳性血清；断颈处死，体积分数75％的酒精腹部消毒，在超净工作台内，无菌摘取脾脏，去除脂肪和结缔组织，置于200目灭菌金属网上，用灭菌玻璃注射器芯轻轻研磨脾脏，同时缓慢滴加无血清DMEM培养液；收集脾细胞悬液，并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心5min，弃去上清，重悬于5mL无血清DMEM培养液中，脾细胞计数后备用；

步骤S24、细胞融合：

利用聚乙二醇对免疫小鼠脾细胞和Sp2/0进行融合，选择状态良好且呈对数生长的Sp2/0细胞6-8瓶，将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用5mL无血清DMEM培养液悬浮，普通光学显微镜下用细胞计数板计数；将Sp2/0细胞和免疫脾细胞悬液混匀，脾细胞数与骨髓瘤细胞数的比例应维持在5：1到10：1之间；以1000r/min离心10min，弃去上清；轻轻弹击融合管底，使细胞块松散；用滴管往管中缓慢加入1mL37℃预热的50％聚乙二醇，60S内加完，静置90S；在5min内先慢后快逐滴加入37℃预热的无血清DMEM培养液，共加10mL，轻摇混匀后，以1000r/min离心10min，弃去上清；用HAT培养液重悬细胞，随即移入60mL的HAT培养液中，轻轻混匀，然后按100μL/孔转入96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养；

步骤S25、杂交瘤细胞的筛选：

融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，第六日用HAT培养液进行第1次半量换液，第8-10日左右，待细胞长到孔底的1/4-1/3时吸出上清进行间接ELISA检测；以S/N≥2.1作为阳性判断标准，用Sp2/0细胞培养上清及正常小鼠血清作阴性对照，免疫阳性血清作阳性对照；用包被缓冲液将p-tau-181多肽和tau重组蛋白稀释至1μg/mL分别包被酶标板中，每孔100μL，37℃温育2h，洗板3次，加入封闭液37℃温育2h，洗板待用；加入杂交瘤细胞培养上清100μL，用三次免疫后的小鼠血清1：1000稀释做阳性对照，用无血清的DMEM及正常小鼠血清作阴性对照，37℃反应30min洗板3次，加入100μL羊抗鼠酶标二抗，反应30min后洗板3次，加入100μLTMB显色液37℃温育10min，加入50μL终止液，450nm测定吸光度，cutoff值等于2.1×阴性值；

步骤S26、杂交瘤细胞的克隆化培养：

制备饲养细胞；HT培养液中制备饲养细胞层100μL/孔；用移液器将ELISA检测具有特异性反应的阳性杂交瘤细胞轻轻吹打混匀，取样，细胞计数，然后用HT培养液调整细胞数；首次亚克隆时调整细胞数至15-20个/mL，第二、第三次亚克隆时调整细胞数至10个/mL；将杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞层的96孔细胞培养板中，100μL/孔、置37℃、含5％CO₂培养箱中进行培养；每日观察并记录每孔细胞克隆数，待细胞长到孔底的1/4-1/3时半量换液，并对细胞上清进行间接ELISA检测；选择克隆数少、吸光度450nm值高的阳性孔，将其再次克隆；经3-4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株。