[发明专利]猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗

权利要求书

1.猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，其特征在于：所述抗原由猪圆环病毒2型抗原、猪伪狂犬病毒抗原和支原体抗原组成，所述猪圆环病毒2型抗原为纯化浓缩并灭活的猪圆环病毒2型蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述猪伪狂犬病毒抗原为纯化浓缩并灭活的猪伪狂犬病毒蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述支原体抗原为灭活的支原体蛋白抗原液，Cap蛋白含量≥160μg/ml；所述疫苗佐剂由水性高分子聚合物佐剂和复合多糖类免疫增强剂构成。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，其特征在于：所述水性高分子聚合物佐剂为Montanide Gel，所述复合多糖类免疫增强剂为中药多糖水溶性复合物。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，其特征在于：所述猪圆环病毒2型抗原、猪伪狂犬病毒抗原和支原体抗原按照体积比为1:1:1。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，其特征在于：所述猪圆环病毒2型病毒液的病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml。

5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，其特征在于：所述猪伪狂犬病毒液的病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml。

6.根据权利要求1所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗，其特征在于：所述支原体病毒液的病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml。

7.如权利要求1-6所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪圆环病毒2型毒株CCTCC-V201333，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7-10天；

S2、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种猪伪狂犬病毒毒株CCTCC-V201654，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7-10天；

S3、将长满致密单层哺乳动物宿主细胞，按一定接毒剂量接种支原体病毒毒株CCTCC-V201317，并加入细胞维持液，在37℃下继续培养7-10天；

S4、当以上三种细胞的病变程度均在90％以上时，分别收获病毒液，并反复冻融2次后，并通过离心机6000r/min离心10分钟，分别取上清液加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，静置12h并在4℃室温下过夜，经中空纤维膜过滤，分别得到猪圆环病毒2型病毒液、猪伪狂犬病毒液和支原体病毒液，保存于-40℃以下，备用；

S5、对收获的病毒液分别进行病毒含量和纯净性检验，所述猪圆环病毒液、猪伪狂犬病毒液和支原体病毒液的病毒含量均≥10^7.0TCID₅₀/ml，纯净性检验合格的病毒用于配制疫苗；

S6、将上述检验合格的三批病毒液经过2000～5000r/min低速离心，2次微孔滤膜澄清过滤并经100KD～1000KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，分别得到得猪圆环病毒2型浓缩液、猪伪狂犬病毒浓缩液和支原体病毒浓缩液；

S7、分别向步骤S6中澄清过滤纯化后的三批病毒液加入0.3％所得病毒液体积的灭活剂，搅拌灭活24～48小时，灭活过程中将灭活体系pH稳定控制在7.0～7.4之间；

S8、将检验合格的病毒液按1:1:1体积比例混合，即得猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体的三联活疫苗。

8.根据权利要求7所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述猪圆环病毒2型的宿主细胞为乳猪肾原代细胞，所述猪伪狂犬病毒的宿主细胞为BHK细胞，所述支原体病毒的宿主细胞为PK15细胞。

9.根据权利要求7所述的猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒和支原体三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S7中所述灭活剂为二乙烯亚胺、β～丙内酯、甲醛以及戊二醛的一种。