[发明专利]一种构建神经组织特异过表达人源SNCA的帕金森病模型猪的方法及应用

权利要求书

1.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将命名为DNA分子甲的DNA分子整合至猪细胞的基因组DNA，得到重组细胞；所述DNA分子甲中具有人源SNCA基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA分子甲中具有人源SNCA基因表达盒；人源SNCA基因表达盒中，启动子为人源神经组织特异性表达启动子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：人源SNCA基因表达盒中，由同一启动子驱动多个拷贝的人源SNCA基因表达。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：人源SNCA基因表达盒中，所述多个拷贝的人源SNCA基因存在于同一编码框，它们之间由自剪接肽的编码基因间隔。

5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述DNA分子甲整合至猪细胞的基因组DNA的COL1A1基因、ROSA26基因、AAVS1基因或H11位点中。

6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述“将命名为DNA分子甲的DNA分子整合至猪细胞的基因组DNA”的实现方式为：将命名为DNA分子乙的DNA分子导入猪细胞或者将具有所述DNA分子乙的重组质粒导入猪细胞；所述DNA分子乙中，具有所述DNA分子甲且在所述DNA分子甲的上游具有上游同源臂且在所述DNA分子甲的下游具有下游同源臂，所述上游同源臂和所述下游同源臂用于将所述DNA分子甲整合至猪细胞的基因组DNA。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法中，具有所述DNA分子乙的重组质粒与两个辅助质粒共同导入猪细胞；所述两个辅助质粒为sgRNA质粒和Cas9质粒；

sgRNA质粒转录得到特异sgRNA；所述特异sgRNA为sgRNA_COL1A1-g3、sgRNA_ROSA26-g3、sgRNA_AAVS1-g4或sgRNA_H11-g1；sgRNA_ROSA26-g3的靶序列结合区如SEQ ID NO：13中第1-20位核苷酸所示；sgRNA_AAVS1-g4的靶序列结合区如SEQ ID NO：14中第1-20位核苷酸所示；sgRNA_H11-g1的靶序列结合区如SEQ ID NO：15中第1-20位核苷酸所示；sgRNA_COL1A1-g3的靶序列结合区如SEQID NO：16中第1-20位核苷酸所示；

Cas9质粒表达Cas9蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述Cas9质粒为质粒pKG-GE3；

质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；

所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；

质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；

质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。

9.一种试剂盒，包括权利要求6中所述的DNA分子乙；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备帕金森病模型猪；(c)制备帕金森病细胞模型或帕金森病组织模型或帕金森病器官模型。

10.一种试剂盒，包括具有权利要求6中所述的DNA分子乙的重组质粒；所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备帕金森病模型猪；(c)制备帕金森病细胞模型或帕金森病组织模型或帕金森病器官模型。