[发明专利]蛋白质的选择性还原

说明书

本发明提供一种制备脱封端的半胱氨酸蛋白质制剂的方法，包括脱封端的工程化的半胱氨酸抗体制剂。所述方法包括，其中，将还原试剂与工程化的半胱氨酸抗体分子接触，每个抗体分子具有至少一个封端的工程化的半胱氨酸残基和至少一个链间二硫键，以及将还原试剂与抗体分子在足以脱封端工程化的半胱氨酸残基并形成封端副产物的条件下反应。所述方法还包括在还原反应过程中移除封端副产物。基本上所有还原前存在于抗体分子中的链间二硫键在还原反应后被保留。还描述了抗体偶联物以及采用脱封端的抗体制剂来制备抗体偶联物的方法。

本申请是2015年2月11日提交的发明名称为“蛋白质的选择性还原”的申请号为2015800083064的中国发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年2月11日提交的美国专利申请号61/938,378的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。

发明背景

选定的氨基酸被突变成半胱氨酸Cys的单克隆抗体(例如工程化的半胱氨酸mAbs，即ecmAbs)特别适合用于偶联物(例如抗体药物偶联物(ADCs))，因为这些由其衍生的偶联物具有有利的特性，其中包括同质性、有利的药物动力学、稳定性和溶解性。这些半胱氨酸突变被置于在抗体氨基酸序列中的某些位置，这些位置通常不会形成链间或者链内的二硫键，并且在细胞内产生突变mAb的表达机制会将半胱氨酸残基作为未配对的半胱氨酸进行处理。因此，工程化半胱氨酸，通常会用非编码的半胱氨酸分子以混合的二硫键产物形式表达(例如，工程化半胱氨酸通常用封端剂(例如半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸、谷胱甘肽)进行“封端(capped)”)。

因此，为了从ecmAbs出发制备偶联物(例如ADC)，通常需要将ecmAb置于还原条件下，从而将工程化半胱氨酸从混合的二硫键产物转化为自由巯基，通常这一“脱封端”或者“活化”伴随着ecmAb链间二硫键的还原。尽管链间二硫键可以通过温和氧化重新形成，但是这种再氧化步骤增加了ADC制备过程中复杂性和费用。选择性还原方法是难以实现的，因为已证明难以还原工程化半胱氨酸残基的同时而不还原链间二硫键。因此，需要开发用于对工程化半胱氨酸残基的进行脱封端的选择性还原方法。本发明解决了这个和其它需求。

发明概述

在本发明中，提供了一种选择性还原工程化的半胱氨酸抗体的方法。这种方法包括：将一还原剂与工程化的半胱氨酸抗体分子接触，每个抗体分子含有至少一个封端的工程化的半胱氨酸残基和至少一个链间二硫键，以及将还原剂与抗体分子在足以使工程化的半胱氨酸残基“脱封端”并且形成封端副产物的条件下进行反应。封端副产物在还原反应的过程中被移去。这种方法导致形成脱封端的工程化半胱氨酸抗体制剂。这种脱封端的工程化半胱氨酸抗体制剂可以包含封端的和脱封端的工程化半胱氨酸抗体。还原反应前存在于抗体分子中基本上所有的链间二硫键，在脱封端的工程化半胱氨酸抗体制剂中仍然保留。所述方法可以进一步包括以下步骤：在移除封端副产物时，向还原反应补充额外的还原剂。在还原反应过程中从反应混合物中移除封端副产物，可以通过例如透析或渗滤进行。在优选的实施方式中，在还原反应混合物中，封端副产物浓度被维持低于如下浓度：在该浓度下，再封端阻止了工程化半胱氨酸残基被进一步活化。

在某些方面，所述方法提供一种非封端的工程化半胱氨酸抗体制剂。典型地，在抗体制剂中至少60％的工程化的半胱氨酸是非封端工程化的半胱氨酸残基。在某些方面，在抗体制剂中至少70％，至少75％或者至少80％的工程化的半胱氨酸残基是非封端工程化的半胱氨酸残基。在某些方面，采用本发明方法，在抗体分子中至少85％的还原反应前就存在的链间二硫键在脱封端工程化的半胱氨酸抗体制剂中仍然保留。在某些方面，选择还原剂和还原条件，使得不超过20％，不超过15％，不超过10％或者不超过5％的抗体分子中存在的链间二硫键，在还原反应过程中被转化成一对自由巯基。

在相关方面，这个发明提供抗体偶联物，包括抗体药物偶联物，和采用脱封端抗体制备抗体偶联物的方法。在制备抗体药物偶联物之前，抗体制剂中残留的还原剂被移除。