[发明专利]HPSEC-RI法检测多糖并与Sepharose CL-4B法关联的方法

说明书

HPSEC‑RI法检测多糖并与Sepharose CL‑4B法关联的方法，通过HPSEC‑RI方法，利用三根高效分子排阻色谱柱测定多糖分子大小及其分布，并将其转化为琼脂糖凝胶(Sepharose)CL‑4B法K_D值和回收率。该方法与Sepharose CL‑4B法线性相关性高，对原有质量标准改动小，用时短，样品用量少，提供了新的测定多糖分子大小分布的方法和标准，为多糖疫苗的研究、检验及申报提供参考，为发展更为高效的分子大小测定方法提供数据支持。

技术领域

本文涉及将通过HPSEC-RI法测定多糖分子大小分布，特别是多糖的分配系数K_D值和多糖回收率，并且将其转换为Sepharose CL-4B法测定的多糖K_D值和回收率的方法。

背景技术

从病原菌中提取的荚膜多糖已被用于预防肺炎和脑膜炎等重要疾病的疫苗生产。多糖疫苗是由这些带有荚膜的细菌经过发酵培养，提取细菌的荚膜多糖抗原后纯化制成，用于预防相应细菌引起的疾病，主要包括脑膜炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖疫苗等。荚膜多糖在细菌培养和多糖纯化过程中形成具有重复单元数量不同的一系列分子量不均一的多糖混合物，例如A群脑膜炎球菌多糖为由→6-α-D-ManpNAC(3/4OAC)-1-PO₄→重复单元组成的多糖混合物。其中，多糖的分子大小是影响多糖免疫原性的重要指标，因此，分子大小分布是测定多糖混合物中多糖大分子和小分子分布情况的检测项目。

《中国药典》2020版三部在测定多糖分子大小分布时采用琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-4B法检测多糖分配系数(K_D值)和多糖的回收率来控制多糖质量。该方法是中国药典、欧洲药典、WHO规程等法定检验标准所使用的传统方法，多糖类疫苗大多基于此方法的检测结果批准上市。但是，该方法存在以下缺陷：由于该方法采用手工填充色谱柱，不同人填充的色谱柱分离效果可能存在一定差异，导致检测结果不稳定；另一方面，Sepharose CL-4B琼脂糖凝胶机械强度较低，耐压性不足，洗脱流速一般控制为0.3ml/min，加之色谱柱较长，检测一个样品常常需要12小时以上；并且实验室中普遍未配备低压凝胶色谱的自动进样系统，均采用单针手动进样的方式，导致检测效率较低。

近年来，高效分子排阻色谱(high performance size exclusionchromatography，HPSEC)方法以快速、高效、稳定等特点在生物检测领域的应用越来越广泛。然而，现有技术中并未公开HPSEC-RI法检测多糖的质量标准与Sepharose CL-4B法标准之间的关系，缺乏将两者快速有效关联的方法。因此，需要提供一种用于将上述两种方法检测的多糖相关数据进行桥接的方法。

发明内容

本申请提供了一种利用HPSEC-RI法测定多糖分子大小分布并将其转换为Sepharose CL-4B标准的方法，具体地，该方法通过高效分子排阻色谱-示差折光检测器(HPSEC-RI)法测定多糖分子的分配系数K_D值和回收率，将所得结果与琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-4B法所得结果之间建立线性回归，从而将两种检测方法有效桥接。该方法为多糖类疫苗的研究、检验及申报提供参考，为发展更为高效的分子大小分布替代方法提供数据支持。

本申请涉及一种HPSEC-RI法测定多糖分子大小分布转换为Sepharose CL-4B法标准的方法，所述方法包括：

高效分子排阻色谱-示差折光检测器法测定所述多糖的分配系数K_DHPSEC-RI和回收率_HPSEC-RI；

将所述K_DHPSEC-RI和所述回收率_HPSEC-RI转换为Sepharose CL-4B法的分配系数K_{DSepharoseCL-4B}和回收率_{SepharoseCL-4B}；