[发明专利]一株产还原性脱卤素酶的菌株及其应用

说明书

本发明涉及一株产还原性脱卤素酶的菌株及其应用，属于生物技术领域，所述菌株为假单胞菌YtRDases‑55，分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为：CGMCC No.21296，保藏日期2020年12月4日。本发明所提供的假单胞菌YtRDases‑55遗传稳定性好，培养基成分简单原料成本低，产生的还原性脱卤素酶活力高，底物特异性强，对底物转化率高，可直接利用该菌株全细胞催化2,3,6‑三氯吡啶脱氯合成2,3‑二氯吡啶，具有工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一株生产还原性脱卤素酶的菌株，以及利用该菌株生产的还原性脱卤素酶催化制备2,3-二氯吡啶的方法。

背景技术

2,3-二氯吡啶（2,3-dichloropyridine），白色粉状固体，微溶于水，是新型杀虫剂氯虫苯甲酰胺与氰虫酰胺的关键中间体，广泛应用于医药与农药研究领域。随着氯虫苯甲酰胺与氰虫酰胺市场的日益扩大，作为上述两个农药产品的关键中间体，2,3-二氯吡啶的需求必将显著增加，市场前景广阔。现阶段获得2,3-二氯吡啶的途径主要以化学合成法为主。化学合成面临反应时间长，高能耗、有毒副产品及环境污染的难题。如2,3,6-三氯吡啶氢气还原法，对设备和操作条件要求高，安全操作难度大，一般企业不宜采用。2-氯吡啶合成法，得到2,3-二氯吡啶和2,5-二氯吡啶的混合物，后处理困难，总收率不高。微生物转化法将是生产2,3-二氯吡啶最具前景的替代生产方法。

还原性脱卤素酶是一种依赖于VB₁₂和铁硫团簇的酶，通过还原作用选择性剪切碳-卤键，可以用于催化2,3,6-三氯吡啶非氧化脱氯生产2,3-二氯吡啶。还原性脱卤素酶在Sulfurospirillum multivorans、Nitratireductor pacificus等微生物中发现，在环境中有机卤化污染物降解方面具有应用价值。尚未有关于应用还原性脱卤素酶催化合成2,3-二氯吡啶的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供从土壤中分离得到的一株高效生产还原性脱卤素酶的菌株，并应用该菌株产生的还原性脱卤素酶酶法制备2,3-二氯吡啶的方法。

本发明所提供的产还原性脱卤素酶的菌株是从潍坊地区土壤中分离得到，这是一株还原性脱卤素酶分泌能力较高的菌株，培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以直接用于酶法制备2,3-二氯吡啶。将其编号为YtRDases-55，分类命名为假单胞菌Pseudomonassp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.21296，保藏日期2020年12月4日。

本发明还提供利用所述菌株产生的还原性脱卤素酶催化制备2,3-二氯吡啶的方法如下：

1）菌株活化：挑取菌种划线接种至斜面培养基，于恒温培养箱30℃培养16～24h；

2）液体发酵：挑取一环斜面活化菌株接种于装有发酵培养基的培养容器中，转速200r/min、温度30℃，得到还原性脱卤素酶的发酵液，培养72h，8000r/min离心20min收集菌体细胞；

3）全细胞催化2,3,6-三氯吡啶制备对2,3-二氯吡啶：将2,3,6-三氯吡啶加入体积比10%的甲醇水溶液中，2,3,6-三氯吡啶与甲醇水溶液的质量体积比为：2：1000-10：1000（g/ml），调pH至7.0，搅拌均匀，加入和甲醇水溶液等体积发酵液离心后收集的菌体进行反应，温度37～60℃，维持转速在50 r/min，反应3～10h。

进一步，所述的斜面培养基的成分及终浓度：葡萄糖 1g/L、酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L和琼脂 20 g/L，调节含有上述成分溶液的pH为 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min即得到所述斜面培养基。