[发明专利]一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法

说明书

本发明提出一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法，首先合成葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料，该材料可以利用亲水作用特异性富集糖基化肽段，而将大分子的蛋白排阻在介孔外。本发明方法简单、成本低廉，材料具有较好的亲水性和生物兼容性，实现了对糖基化肽的高灵敏度和高重复性的富集，结合MALDI‑TOF MS或者nano‑LC‑MS/MS能够实现大规模鉴定内源性糖基化肽，在内源性肽组学中具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法，具体涉及使用新型磁性亲水性纳米介孔吸附材料分离富集内源性糖基化肽的方法，尤其涉及一种基于葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料选择性富集提纯内源性糖基化肽的方法。

背景技术

人类血清是人体最复杂、最重要的体液之一，携带大量生物学信息，对运输物质，酸碱平衡，细胞免疫等多种生理功能起重要作用。因此，科学家认为血清的变化，包括血清中肽组学的变化，可以对多种疾病进行评估，如乳腺癌、肝癌、肺癌。此外，通过分泌途径，内源性肽可以通过各种翻译后修饰进行加工，包括糖基化、磷酸化和乙酰化。糖基化可以调节细胞粘附，免疫调节和信号转导等生理及病理过程。因此，血清内源性糖基化肽的研究在疾病生物标志物的发现中具有极为重要的前景。然而，在复杂的生物样品中，内源性糖基化肽的丰度低、电离效率差，给直接用质谱法分析内源性糖基化肽带来了很大的挑战。因此，探索高效、特异的内源性糖基化肽富集方法是至关重要的。

到目前为止，已经发展了从复杂生物样品中鉴定糖基化肽的多种富集策略，包括凝集素亲和层析，共价结合法，肼化学法，基于螯合作用富集法，亲水相互作用色谱法（HILIC）。由于糖基化肽具有大量羟基呈现极高亲水性，而非糖基化肽有较高疏水性，在这些策略中， 基于HILIC策略的材料呈现出色的亲水性和无偏性结合糖肽的特点，因此HILIC策略是最常用的策略之一。然而，这些亲水介质由于亲水性程度不同，导致糖基化肽识别的不充分性。因此，发展产生了大量的亲水性材料，提高了对糖基化肽的富集效率，从而使糖基化肽的分析更为全面。在这些材料中，介孔材料由于具有出色的尺寸排阻作用，可从含有高浓度蛋白质的复杂生物样品中选择性富集内源性糖基化肽，而将大分子蛋白排阻在孔道外，对内源糖肽的富集发挥了良好的作用。因此，有必要制备一种既具有高亲水性又具有体积排阻能力的探针，以便于高效鉴定内源性糖基化肽。

发明内容

本发明提出了一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法，制备一种葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料，并将其应用于血清中内源性糖基化肽的富集。制备的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料具有高亲水性、独特的介孔结构和优异的磁响应性。糖基化肽的羟基和葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的羟基可以形成复杂的氢键网络，从而提高了对糖基化肽富集的检测灵敏度。此外，葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料成功地用于富集健康人和乳腺癌患者血清中的内源性糖基化肽，并发现识别到的内源性糖基化肽与不同的生物学过程特异性相关，为进一步通过糖基化肽研究寻找疾病生物标志物开辟了新的途径。这表明其在肽组学研究和疾病诊断方面的巨大潜力。本发明目的在于提供一种葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其在内源性糖基化肽的富集纯化中的应用。

本发明提供一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法，具体步骤如下，将葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料与上样缓冲溶液混合配置成材料分散液；取10-20μL材料分散液和目标糖基化肽溶液加入上样缓冲液中；37℃下孵育30分钟，用上样缓冲液洗涤，加入10μL含有体积比30%乙腈和体积比0.1%三氟乙酸的洗脱缓冲液，37℃下孵育30分钟，将洗脱液点靶，进行质谱分析；

其中，葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料与上样缓冲溶液的重量体积比为10g：1L；

其中，上样缓冲液为含有体积比90%的乙腈和体积比1%的三氟乙酸的缓冲溶液；

其中，葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，具体步骤如下：