[发明专利]猪肺泡巨噬细胞健康细胞系及构建方法与应用

说明书

本发明公开了猪肺泡巨噬细胞健康细胞系及构建方法与应用，该猪肺泡巨噬细胞健康细胞系的保藏编号为：CGMCC No：21498。本发明的猪肺泡巨噬细胞健康细胞系采用特殊的细胞培养液结合自然驯化选择的方法筛选100％健康的猪肺泡巨噬细胞系，其可应用于病毒的细胞培养、用于活疫苗和灭活疫苗的研发和生产以及制备诱导极化后M1和M2巨噬细胞分泌的生物活性物质分别用于癌症治疗和消炎等。本发明首创培养出了猪肺泡巨噬细胞健康细胞系，本发明的构建方法没有采用慢病毒转化或质粒转染等任何致癌性物质，所构建的健康的猪肺泡巨噬细胞系保有原代猪肺泡巨噬细胞的特质。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及猪肺泡巨噬细胞健康细胞系及构建方法与应用。

背景技术

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞之一。猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolarmacrophages,PAM)是机体抵抗病原感染的重要组成部分，不但具有吞噬和抗原提呈功能，而且还分泌大量的生物活性物质，可以提高免疫炎性反应，也能抑制炎症的发生。猪肺泡巨噬细胞也是许多病毒感染和攻击的靶目标，因此这些病毒和相应的疫苗病毒可以在猪肺泡巨噬细胞大量复制和繁殖，例如非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒等等。

目前，国内外都已经利用慢病毒转化和SV40大T抗原质粒转染制备了永生化的肺泡巨噬细胞，即肺泡巨噬细胞细胞系，这些肺泡巨噬细胞细胞系已经用于实验室研究。专利号为CN110195080A的专利用稳定表达CD163受体蛋白的重组质粒和重组慢病毒构建了猪肺泡巨噬细胞系，该重组质粒是以慢病毒表达载体pLV-sfGFP[2A]Puro为基础构建的，并整合有CD163编码基因，并采用特殊的慢病毒系统将CD163基因整合到永生化的PAM细胞染色体上，使得永生化的PAM细胞系能够永久性地稳定表达CD163蛋白，而使细胞易受PRRSV感染。PRRSV在该细胞系(mPAM-CD163)上的毒价可以高达10^6.9TCID₅₀/0.1mL，且能够稳定传代。专利号为CN110577934A的专利中将含有sgRNA的重组慢病毒转染猪肺泡巨噬细胞，经抗性筛选得到所述TLR4基因敲低的猪肺泡巨噬细胞系。与未敲低的细胞系相比，构建的敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系可以促进口蹄疫病毒复制，该敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系中口蹄疫病毒复制量是前者的2～3倍。

Weingartl等(2002)用pSV3neo质粒(质粒携带新霉素抗性和SV40大T抗原)转染猪肺泡巨噬细胞得到了猪肺泡巨噬细胞系。该猪肺泡巨噬细胞系支持以下病毒的复制：水泡性口炎病毒(VSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪痘病毒、非洲猪瘟病毒(ASFV)、单纯疱疹病毒(HSV)、副流感病毒(parainfluenza virus)、牛腺病毒(BAV)、牛痘病毒和猪腺病毒(PAV)。在试验条件下，该细胞系不支持猪繁殖和呼吸综合征病毒的复制。荷兰英特维特国际股份有限公司用 pSV3amp质粒制备的猪肺泡巨噬细胞系，但细胞系也已经失去了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的敏感表型。

随着新的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒突变株/变异株等新病毒的出现，用Marc145 细胞系分离新出现的猪繁殖与呼吸综合征病毒突变株和用Vero细胞系分离新出现的猪流行性腹泻病毒变异株越来越困难。猪巨噬细胞健康细胞系是其最佳选择，但目前尚没有只靠实验室内自然驯化而不用任何慢病毒转化或任何质粒转染得到的猪巨噬细胞健康细胞系。

发明内容

因此，基于以上背景，本发明的目的之一是提供猪巨噬细胞健康细胞系，该猪巨噬细胞健康细胞系的保藏编号为：CGMCC No：21498。

本发明的目的之二，提供一种能够构建上述的猪巨噬细胞健康细胞系的方法。