[发明专利]一种降低Taqman探针荧光背景的方法

权利要求书

1.一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；

步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′端荧光基团；

步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10-15min后，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3次，每次离心2-3min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3min，得到处理后的合成板；

步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压强为70-90PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5-2h，氨解结束后放掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min；

步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针。

2.根据权利要求1所述的一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：步骤A3所述的DEA-ACN混合液为体积比为2:8的DEA和ACN混合，DEA-ACN混合液的加入量为200μL，所得质量分数90％的ACN的加入量为300μL。

3.根据权利要求1所述的一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：步骤A4所述的质量分数100％的ACN加入量为200μL，质量分数90％的ACN加入量为200μL。

4.根据权利要求1所述的一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：步骤A5所述的TEA的质量分数为5％，TEA的用量为260μL。