[发明专利]一种泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法

权利要求书

1.一种泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：

将泉水鱼的精液与抗冻液按体积比1:30的比例混合，混合后经过程序降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂三部分组成，其中稀释液由NaCl、KCl、CaCl₂·6H₂O、NaHCO₃、葡萄糖和果糖组成，抗冻剂为30％(V/V)甲醇，添加剂为15％(V/V)蜂蜜。

2.按权利要求1所述的泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述稀释液由NaCl、KCl、CaCl₂·6H₂O、葡萄糖和果糖组成：制备方法为取NaCl1.5g，KCl0.01g，CaCl₂·6H₂O0.1g，NaHCO₃0.1g，葡萄糖8.5g，果糖3.0g，溶于800mL双蒸水，热压消毒，冷却，定容至1000mL，即成稀释液。

3.按权利要求1所述的泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻液是将抗冻保护剂与稀释液混合，制成比例为30％甲醇(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱备用。

4.按权利要求1所述的泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：将新鲜的泉水鱼精液与抗冻液按照1:30的体积比混合均匀，移液枪吸取2mL混合液加入到2.5mL的冻存管中。

5.按权利要求1所述的泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：用移液枪吸取300μL新鲜蜂蜜加入到冻存管中，充分混匀，随后放入4℃冰箱预冷5min。

6.按权利要求1所述的泉水鱼精子高效超低温冷冻保存的方法，其特征在于：将分装后的精液采用三步程序降温法降温处理，再投入液氮中长期保存，程序降温程序为0～-40℃区间，-5℃/min；-40～-70℃区间，-10℃/min；-70～-130℃区间，-20℃/min。

7.按权利要求1所述的泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：将分装保存于液氮中的泉水鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时用镊子将冻存管从液氮中取出，空气中停留3-5秒，然后迅速将冻存管放入25℃恒温水浴锅中水浴解冻，轻轻晃动至只剩一点冰核时取出。

8.按权利要求1所述的泉水鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：吸取精液，在生理盐水中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标。