[发明专利]一组快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的引物及应用

说明书

本发明公开了一组快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的引物及应用，包括引物组：一组LDR引物LDR‑1、LDR‑2和一组PCR引物LDR‑UF、LDR‑UR，各条引物均为单链DNA分子；本发明将连接酶检测反应与聚合酶链式反应联用，可以检测长度低至40nt、高度降解的碎片化RNA中所含有的点突变，而现有逆转录‑荧光定量PCR技术只能检测长度在100nt以上的RNA模板。

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，具体为快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的特异性引物及检测方法。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)所引发疾病(COVID-19)是新中国成立以来传播速度最快、感染范围最广、防控难度最大的重大突发公共卫生事件，也是世界卫生组织认定的全球大流行传染病。

新冠病毒属于单链正义RNA病毒，在复制过程中十分容易发生突变，目前研究者已经发布了近8万个新冠病毒基因序列。尽管绝大多数基因突变都不会影响病毒的毒性和传染性，但据报道，新冠病毒 S蛋白的D614G突变，可显著增强病毒的感染能力，并且降低了病毒对患者恢复期血清的敏感性。如何在病毒核酸检测时快速区分这些 SNP位点，一直是研究者关注的重要问题。

新冠病毒的遗传物质为单链RNA，相对双链DNA而言更加不稳定。当采样、核酸提取和保存过程中操作不当，或存在核酸酶、酸、碱等物质时，很容易降解，断裂为小片段。目前主要的核酸SNP检测手段主要包括荧光定量PCR和测序法等。

目前主流的核酸SNP检测手段包括探针法荧光定量PCR和测序法。测序法最为准确，但耗时较长，不利于临床快速检测。探针法荧光定量PCR检测RNA病毒上的点突变，首先需要将病毒RNA逆转录为cDNA，然后使用一对根据突变位点上下游设计的PCR引物，以及一条覆盖突变位点的Taqman-MGB荧光探针进行荧光定量PCR。由于Taqman探针需要设计在两条引物之间，探针法荧光定量PCR需要的模板长度一般不低于100nt，如果病毒核酸在提取和保存过程中受到破坏，碎片化程度较严重，则难以检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，利用连接酶检测反应 (LDR)技术结合荧光定量PCR技术，提供快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的特异性引物及检测方法，以解决上述背景技术提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的特异性引物，包括检测新冠病毒S基因的LDR 引物组LDR-1、LDR-2和PCR引物组LDR-UF、LDR-UR，各条引物均为单链DNA分子；所述LDR引物组包含2条引物，其中LDR-1 的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.1，LDR-2的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.2；所述PCR引物组包含2条引物，其中LDR-UF的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.3，LDR-UR的核苷酸碱基序列为SEQ IDNo.4。

引物组在快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变中的应用，

具体的检测方法如下：

步骤一：获取病毒RNA；

步骤二：以步骤一获取的RNA为模板，加入权利要求1所述的 LDR引物对LDR-1/LDR-2配制LDR反应混合液，进行LDR反应；

步骤三：使用权利要求1所述的PCR引物LDR-UF和LDR-UR 对步骤二的反应产物进行荧光定量PCR反应，然后进行结果评判。

所述步骤二中的LDR反应中，所用的耐热连接酶可以是Taq ligase或Tth ligase。

本发明的有益效果是：本发明可以检测长度低至40-50nt、高度降解的RNA中所含有的点突变，而现有逆转录-探针法荧光定量PCR 技术只能检测长度在100nt以上的RNA模板。

附图说明