[发明专利]一种用于早期检测重型乙肝病毒的生物标志物及其检测试剂盒与应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于早期检测重型乙肝病毒的生物标志物及其检测试剂盒与应用。本发明提供了一种用于早期检测重型乙肝病毒的生物标志物，所述生物标志物序列如SEQIDNO.1所示。本发明还提供了一种所述生物标志物在制备早期检测重型乙型肝炎病毒试剂盒中的应用以及一种用于早期检测重型乙型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测GSTM3甲基化的引物对、探针，以及用于检测内参基因ALU‑C4的引物对、探针。本发明检测方法能够检测到人体外周血中极微量的DNA，灵敏度高，特异性强，被广泛应用于检测DNA含量少、损失率高的标本。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于早期检测重型乙肝病毒的生物标志物及其检测试剂盒与应用。

背景技术

重型肝炎是在慢性肝病或肝硬化基础上出现的大量肝细胞坏死为主要病理特点的一种严重肝脏疾病，其主要表现为黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病及腹水等，并发症发生率高，是肝病患者死亡的主要原因之一。我国属于乙型肝炎高流行区，乙肝病毒感染是我国重型肝炎的主要病因。重型乙型肝炎病情凶险，预后差，病死率极高。目前临床上尚无评估临床治疗效果的有效方法与手段。因此，迫切需要开发用于评估重型乙型肝炎临床疗效的方法，有助于临床医生监测病情进展，制订有效的治疗措施，降低重型乙型肝炎死亡率。

表观遗传学已被证实参与慢性HBV感染的重症化过程，并在其中发挥重要作用，其中包括异常的DNA甲基化。DNA甲基化是指基因表达的可遗传变化，在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸中的甲基转移到特定碱基上的过程。在人类基因组中，DNA甲基化主要出现在特定基因启动子区的CpG岛的胞嘧啶上，从而抑制基因的转录，使基因表达沉默。多项研究表明，某些基因的DNA甲基化可以用作分子生物学标志物辅助临床疾病的诊断预后。

谷胱甘肽抗氧化酶系统是人体内重要的酶系抗氧化系统。该系统主要包括谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)。其中，GST是参与人体内生物转化的Ⅱ相代谢酶。GST主要存在于肝细胞内，可使有害的亲电物质与GSH结合，将其排出体外。除此之外，GST也可促进GSH与毒性代谢产物结合，清除自由基，从而发挥保护机体核酸和蛋白质的功能。GST超家族主要有8个亚家族—α、μ、π、θ、τ、σ、ο和κ。其中，谷胱甘肽S-转移酶M3(GSTM3)是μ亚家族的重要成员之一，它在与环境致癌物质的结合与脱毒过程中作用巨大，同时也具有极强的抗氧化能力。研究表明，GSTM3基因甲基化程度与其表达水平间存在明显的负相关。GSTM3基因启动子的高甲基化可以使GSTM3表达减低，进而导致机体抗氧化能力减低，氧化损伤加重，正常的肝功能受损。研究表明，GSTM3基因启动子甲基化程度与其表达水平呈负相关。我们既往研究发现，重型肝炎患者体内存在不同程度的氧化损伤。氧化损伤在重型肝炎的发生发展过程中具有重要作用。GSTM3基因启动子高甲基化导致的GSTM3表达减少可加重氧化损伤引起的肝损害。GSTM3基因启动子的甲基化与重型肝炎严重程度之间存在密切关系。因此，经临床治疗后检测重型肝炎患者GSTM3甲基化状态的改变可反映治疗后病情严重程度。

检测DNA甲基化的方法众多，实时定量甲基化特异性聚合酶链反应检测方法是现阶段研究基因甲基化水平的有力手段。该方法是基于Taqman荧光探针的甲基化定量检测方法，结合重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的Taqman探针，通过荧光探针追踪PCR产物，实时反映甲基化特异性PCR过程，分析甲基化特异性PCR产物，从而得到待测样本的甲基化程度。实时定量甲基化特异性聚合酶链反应检测方法可克服甲基化定性检测方法的缺点，消除非特异性扩增，更好的避免DNA污染对结果的影响，确保检测结果的特异度。该检测方法能够检测到人体外周血中极微量的DNA，灵敏度高，特异性强，被广泛应用于检测DNA含量少、损失率高的标本。

因此，如何通过检测GSTM3甲基化程度，提供一种用于早期检测乙型肝炎病毒的生物标志物及其试剂盒来辅助临床疾病的检测乙型肝炎病毒，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容