[发明专利]基因多段重复的连接克隆方法

说明书

本发明公开一种基因多段重复的连接克隆方法，包括如下步骤：步骤S1、将引物通过PCR扩增模板得到B片段；步骤S2、用二类酶FaqI和BsaI双酶切第一步的PCR扩增得到的B片段；BsaI单酶切克隆载体V；步骤S3、将步骤S2酶切的PCR产物和载体V等比混合，之后加入T4DNA连接酶连接，制得连接产物；步骤S4、将步骤S3制得的连接产物导入感受态细胞，涂布LB+KanR平板、培养；步骤S5、菌落PCR验证以及提取质粒进行测序验证；使用引物Primer3和Primer4扩增模板，成功扩增出特异性单一条带，并且可用于下一步酶切连接。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为基因多段重复的连接克隆方法。

背景技术

如图1所示，由于目的片段B的5’端基因多处重复，无法直接设计PCR首尾引物Primer 1/2将目的扩增出来(因为Primer 1有4处结合位点，出现非特异性扩增)，然后重组或者连接入目的载体，同时也无酶切位点进行切割，造成基因克隆困难。

二类酶，切割位点和识别位点不唯一，通常用于酶切连接常用酶。此技术背景即利用二类酶这一特性进行克隆连接操作，如图2示例二类酶FaqI酶切示意图；

如图3-5所示，以FaqI为例，识别位点gggac，间隔10碱基之后进行切割，那么我们可以利用这一点，设计引物Primer 1为F正向引物进行扩增，通过在引物5’端加上二类酶识别位点gggac，此引物则不会与模板出现错配现象，二类酶的识别位点gggac其它区域为引物与模板的结合位点，那么我们就可以将B片段PCR扩增下来，之后利用FaqI酶切PCR产物(图3)，连接进入预先设计好的目标载体BsaI酶切相同的粘性末端，完成无缝克隆。

发明内容

为了克服上述的技术问题，本发明提供一种基因多段重复的连接克隆方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

基因多段重复的连接克隆方法，包括如下步骤：

步骤S1、将引物Primer 3gggacctttatatgggctgtta和Primer4GGTCTCacagaacactacttcctataa通过PCR扩增模板得到B片段；

步骤S2、用二类酶FaqI和BsaI双酶切第一步的PCR扩增得到的B片段；BsaI单酶切克隆载体V；

步骤S3、将步骤S2酶切的PCR产物和载体V等比混合，之后加入T4 DNA连接酶连接，制得连接产物；

步骤S4、将步骤S3制得的连接产物导入感受态细胞，涂布LB+KanR平板、培养；

步骤S5、菌落PCR验证以及提取质粒进行测序验证。

进一步地，步骤S1中PCR扩增的具体步骤为：

第一步、称取如下原料：1xPCR缓冲液，1-2mM MgCl₂，200-400nMPrimer3gggacctttatatgggctgtta、200-400nMPrimer4GGTCTCacagaacactacttcctataa，0.05-0.2mM dNTP，1-2U聚合酶；

第二步、将DNA模板、引物、聚合酶、dNTP、1xPCR缓冲液和MgCl₂混合构成PCR体系，之后经过预变性，变性、退火和延伸三个步骤的循环，延伸，将Primer3gggacctttatatgggctgtta和Primer4GGTCTCacagaacactacttcctataa进行扩增，制得B片段。

进一步地，第二步中预变性的温度为90-96℃，预变性时间为2-5min，变性的温度为90-96℃，变性时间为15-30s，退火温度为50-56℃，退火时间为15-30s，延伸温度为70-75℃，延伸时间为15-30s，依次循环26次，之后在65-75℃延伸5-10min。