[发明专利]高效检测融合蛋白/抗体Fc段不能介导ADCC和CDC活性的方法

说明书

本发明属于生物领域，具体涉及一种高效检测融合蛋白或者抗体Fc段不能介导产生ADCC和CDC活性的方法。首先公开了一种检测方法，所述检测方法能够快速找到能介导ADCC和CDC效应的阳性抗体和阳性细胞，且能够直接验证目标蛋白或者抗体的Fc序列不能或者只能微弱介导产生ADCC和CDC效应，所述方法包括：S1、载体的构建：根据Rituximab和IgG4的Fc序列进行密码子优化，合成目的基因并插入质粒中，构建瞬转表达载体；S2、质粒抽提和测序；S3、蛋白瞬时表达；S4、蛋白纯化；S5、ADCC和CDC活性分析。本发明公开的检测方法也能直接验证目标蛋白或者抗体的Fc段不能或者只能微弱介导产生ADCC和CDC效应；检测方法可靠、适用性广且高效。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种高效检测融合蛋白/抗体Fc段不能介导ADCC和CDC活性的方法。

技术背景

Fc融合蛋白或者抗体一般通过人的Fc段的FcRn(新生的Fc受体)介导的循环提高目标蛋白药物的半衰期，改善药代动力学特征，作用机制不依赖于ADCC/CDC活性。一些非癌适应症抗体药物，以及肿瘤免疫疗法抗体药物如PD-1/PD-L1抗体，其作用机制同样不依赖于ADCC(抗体依赖性细胞毒性)、CDC(补体依赖性细胞毒性)活性。这时人的Fc段的细胞毒性作用ADCC、CDC可能带来不必要的副作用。

目前，一些新上市的抗体药物和在研的抗体/融合蛋白药物，正在通过采用IgG2、IgG4亚型或者改造Fc(减弱或者去除ADCC/CDC效应)以得到更好的安全性和稳定性。

目前一些药企证明Fc段不具备或者具有微弱介导ADCC、CDC活性的方案：

一、阳性对照：1)对于Fc突变的抗体或者蛋白要证明其Fc段不能或者只能微弱介导ADCC/CDC效应，其阳性对照为Fc未突变的相同靶点的抗体或者融合蛋白；2)而对于亚型为IgG2或者IgG4的抗体其阳性对照为具有相同靶点亚型为IgG1的抗体。阳性细胞：高表达该靶点的细胞。

缺陷和不足：1)阳性抗体即使在ELISA层面能和Fc受体或者C1q结合，但是不一定能介导效应细胞对高表达此靶点的细胞的ADCC和CDC作用；2)该靶点的阳性对照即使能介导ADCC作用，由于肿瘤细胞在其细胞表面经常高表达一些补体抑制剂如CD46，CD55和CD59，这些分子能够保护靶细胞免受补体的杀伤作用，导致阳性抗体只具有非常弱或者基本没有CDC作用。

阳性对照：已经上市的抗体或者融合蛋白，此抗体或者融合蛋白的靶点(此靶点不同于目标样品的靶点)在所选的阳性靶细胞中也是高表达的；阳性细胞：同时高表达目标靶点和阳性抗体对应靶点的靶细胞。

缺陷和不足：1)同时高表达两种靶点的靶细胞比较难找；2)两个不同的靶点结合不同的靶位，目标抗体和阳性抗体Fc段也不同，在进行ADCC和CDC检测时，即使阳性抗体显示阳性结果，目标抗体显示阴性结果，不能证明是Fab段还是Fc段导致的阴性结果；3)阳性抗体即使在ELISA层面能和Fc受体或者C1q结合，但是有些抗体不能在细胞层面介导ADCC和CDC作用；4)阳性对照即使能介导ADCC作用，由于肿瘤细胞在其细胞表面经常高表达一些补体抑制剂如CD46，CD55和CD59，这些分子能够保护靶细胞免受补体介导的杀伤作用，导致阳性抗体只具有非常弱或者基本没有CDC作用。

发明内容

为了解决上述的现有技术问题，本发明的技术方案把目标蛋白或者抗体的Fc嫁接到已知的抗体上(例如Rituximab)，阳性细胞选用高表达CD20的Raji细胞。阳性抗体即CD20的抗体Rituximab能介导Raji细胞很强的ADCC和CDC效应。本发明公开的检测方法具有阳性抗体，阳性细胞好找，而且阳性抗体确定具有ADCC和CDC效果的优点，同时也能直接验证目标蛋白或者抗体的Fc不能或者只能微弱介导产生ADCC和CDC效应。此方案适用于验证所有Fc段不能或者只能微弱介导产生ADCC和CDC效应。

具体的，本发明的技术方案如下：