[发明专利]一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其具有结核杆菌的免疫原性，相较于常用结核免疫原ESAT6该融合蛋白具有更明显的免疫原性，可作为结核免疫原蛋白初步筛选中的阳性标志物。从而为进一步结核病的早期诊断和新型疫苗的研制奠定了基础，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及结核病技术领域，具体地，涉及一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的传染病，据WHO发布的2019年全球结核病报告数据显示，目前全世界1/4的人口感染了结核分枝杆菌，每年约有1000万新病例发生，HIV阴性人群中，结核病导致约120万人死亡。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，因此，如何早期发现及预防结核病日益引起了世界范围的重视。

结核特异性免疫原蛋白应用于结核免疫学诊断、疫苗等方面。对于结核潜伏性感染患者，常用方法PPD皮试方法，但筛选特异性差、准确率较低。而抗原的外周血单核细胞刺激实验或γ干扰素释放实验明显提高了诊断的灵敏性。ESAT6和CFP10蛋白是结核早期分泌蛋白，作为抗原检测结核分枝杆菌潜伏感染优于TST；并且，ESAT6和CFP10的样品血液检测方法的敏感性和特异性优于PPD皮试；但是，ESAT6及CFP10这些常用免疫原的敏感性仍不是很高。因此，目前结核诊断检测方法有待进一步完善，急需特异性、敏感性更好的结核免疫原，结核免疫原筛选及阳性标志物的选择至关重要。

RD1区域基因编码的蛋白质是结核分枝杆菌主要的毒力因子，在结核疫苗研制开发和检测诊断方面都受到了广泛重视。Rv3872(PE35)、Rv3873(PPE68)是结核分枝杆菌RD1区域基因所编码的，是RD1区域免疫性重要的组成部分，是研究较多的结核免疫原，在血清诊断和细胞免疫学诊断方面展现出较好的前景。有研究证明Rv3872、Rv3873参与病原-宿主相互作用，与细胞免疫应答相关，依赖TLR2受体诱导THP-1巨噬细胞分泌IL-10和MCP-1并降低IL-12p70的分泌，抵御宿主清除。ELISA检测结核患者或BCG接种健康者血清中Rv3872抗体水平，结果表明，肺结核和肺外结核的敏感性分别为92％和89％，特异性分别为95％和91％。Rv3873可诱发T淋巴细胞免疫应答并产生高水平IFN-γ，可应用于结核诊断候选抗原，特异性为92.1％，敏感性为53％(杜凤娇,陈曦,刘菲,等.结核分枝杆菌RD1区编码蛋白在结核病诊断中的潜在价值[J].中国医学科学院学报,2009.)，。Rv3872、Rv3873可激发细胞免疫应答，已用于DNA菌苗的研制，可作为预防和治疗结核病的候选菌苗。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种具有结核杆菌免疫原性的融合蛋白及其应用。该融合蛋白表达量高、上清表达、活性高；可作为在巨噬细胞结核免疫原蛋白筛选时阳性标志物应用，该融合蛋白具有较好的免疫原性，通过免疫原蛋白ESAT6与Rv3872-3873重组融合蛋白分别刺激巨噬细胞，其中ESAT6蛋白作为参考免疫原，检测细胞因子分泌情况，Rv3872-3873刺激巨噬细胞IFN-γ、IL-6、IL-8细胞因子含量有着明显变化，

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明要求保护以下内容：

一种融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，携带有所述的编码基因。

一种工程菌，携带有所述的重组载体。

本发明还要求保护所述的融合蛋白的制备方法，诱导培养所述的工程菌、收集菌体、破碎菌体、收集上清、经过镍柱亲和层析、G25层析柱除盐和DEAE阴离子交换层析，即得。