[发明专利]基于共表达分泌性荧光素酶滴定重组杆状病毒的方法

说明书

本发明涉及一种简便快速定量重组杆状病毒的方法，具体而言，该方法是通过检测共表达的荧光素酶活性来定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。本发明公开了一种分泌性荧光素酶表达盒：hr5增强子‑IE1启动子‑L21‑secrNluc‑IE1终止子，其核酸序列如SEQ ID NO：1所述。本发明还同时公开了一种基于共表达分泌性荧光素酶快速滴定重组杆状病毒的方法。采用本发明的方法数分钟内就能完成测定酶活。

技术领域

本发明涉及一种简便快速定量重组杆状病毒的方法，具体而言，该方法是通过检测共表达的荧光素酶活性来定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。

背景技术

自上个世纪80年代建立以来，杆状病毒载体表达系统已经发展成基因工程领域常用的分子生物学工具，可以用来克隆目的基因高效表达重组蛋白制备蛋白药物或疫苗，或者用作DNA载体传递目的基因进行基因治疗。不管是重组表达还是基因治疗，构建的重组杆状病毒都必须评估病毒毒力，即病毒的感染能力，以便达到最佳的应用效果。

病毒毒力或毒价可以定义为单位体积中活病毒颗粒的数量，即病毒滴度，通常通过观察病毒感染产生的细胞病变效应来评价。常规测定病毒滴度的方法就是基于这个原理，主要有蚀斑法(plaque formation assay,PFA)和终点稀释法(end point dilutionassay,EPDA)。细胞病变是一个缓慢的病理过程，观察到重组杆状病毒感染引起的典型细胞病变可能需要5-7天，因而这两种方法非常耗时。同时，这两种方法的检测结果也易受样品孵育条件和操作者技能的影响。为了缩短观测/检测时间，简化操作，提高准确性，一些改良方法相继发展出来(A,Oliveira R,Carrondo MJ,Alves PM.Error assessment inrecombinant baculovirus titration:evaluation of different methods.J VirolMethods.2009,159:69-80)。但总体而言，这些方法操作步骤复杂，检测效率不高，检测结果常常不稳定。如，利用报告基因GFP或LacZ共表达检测滴度，需要人工观察荧光或显色反应，而半乳糖苷酶活性分析灵敏度低偏差大，结果易受病毒孵育时间和操作者的经验影响(ChaHJ,Gotoh T,Bentley WE.Bentley,Simplification of titer determination forrecombinant baculovirus by green fluorescent proteinmarker.Biotechniques.1997,23:782–784；Hopkins RF,Esposito D,A rapid method fortitrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cellline.Biotechniques.2009,47:785–787；Yahata T,Andriole S,Isselbacher KJ,ShiodaT,Estimation of baculovirus titer by beta-galactosidase activity assay ofvirus preparations.Biotechniques.2000,29:214–215)；利用杆状病毒结构蛋白抗体免疫检测滴度操作复杂，工作量大(BacPAK^TM Baculovirus Rapid Titer Kit User Manual；Kwon MS,Dojima T,Toriyama M,Park EY.Development of an antibody-based assayfor determination of baculovirus titers in 10hours.Biotechnol Prog.2002,18:647-651；Wang W,Cheng T,Ma K,et al.Development of a novel baculovirustitration method using the Enzyme-linked immunosorbent spot(ELISPOT)assay.JVirol Methods.2013Mar；188(1-2):114-20.)；利用病毒感染导致的细胞形态变化检测滴度，包括大小(Janakiraman V,Forrest WF,ChowB,Seshagiri S,A rapid methodfor estimation of baculovirus titer based on viable cell size.J VirolMethods.2006,132:48–58)和侧面光散射性(Qi J,Liu T,Pan J,Miao P,Zhang C.Rapidbaculovirus titration assay based on viable cell side scatter(SSC).Anal ChimActa.2015,879:58-62)，通常需要足够的病毒孵育时间(至少20小时)，并且易受细胞生长状态的影响；利用病毒感染导致的细胞生理生化变化检测滴度，如染料代谢和凋亡，需要染色或紫外诱导凋亡，操作步骤复杂，耗时长(Pouliquen Y,Kolbinger F,Geisse Setal.Automated baculovirus titration assay based on viable cell growthmonitoring using acolorimetric indicator.Biotechniques.2006，40:282,284,286；Niarchos A,Lagoumintzis G,Poulas K.Utilizing the virus-induced blocking ofapoptosis in an easy baculovirus titration method.Sci Rep.2015,5:15487)。