[发明专利]基于基因编辑技术的GBSSI突变型蛋白及其在植物育种中的应用

说明书

本发明公开了水稻直链淀粉合成酶GBSSI突变型蛋白、其编码基因及在育种中的应用，所述GBSSI突变型蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应的水稻GBSSI氨基酸序列的第178位氨基酸发生突变，本发明还公开了利用基因编辑创制直链淀粉含量5％左右水稻的育种方法。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对Waxy基因进行定点突变，通过后代筛选，在T1代可以获得剔除Cas9元件的新材料，而新材料的基本农艺性状与野生型相比无明显改变。相对于传统的化学诱变育种和杂交育种等手段，基因编辑定向改良分子育种技术具有高效、精准等优点，极大提高育种效率、加快育种进程。

技术领域

本发明涉及水稻遗传育种、糯性品质改良邻域，具体地，本发明涉及基于基因编辑技术的GBSSI突变型蛋白及其在植物育种中的应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，随着人们生活水平的提高，对优质水稻品种的需求进一步增大。水稻直链淀粉含量影响水稻糯性，进而影响稻米的品种和口感。高直链淀粉稻米的糊化温度较高，胶稠度降低，煮成米饭的黏性、光泽度及柔软性都比较差；低直链淀粉含量的稻米，煮成饭后米粒晶莹、口感软糯，从而备受人们青睐。因而，通过降低水稻中的直链淀粉含量从而来改善稻米品质一直以来是育种家的目标。

水稻中直链淀粉主要由水稻蜡质基因Waxy(Wx)编码的颗粒结合淀粉合成酶(GBSSI)催化合成。研究表明Waxy是控制稻米直链淀粉含量的主效基因，目前大部分基于水稻品质的分子遗传育种都是围绕该基因进行的。在栽培稻中存在三个主要的Wx等位基因，Wx^a、Wx^b和wx。wx存在于糯稻品种中，是Wx基因的功能缺失形式，wx稻米中没有直链淀粉或者直链淀粉含量非常低(小于2％)。Wx^a等位基因存在于大多数籼稻品种中，而大多数粳稻品种含有Wx^b等位基因。这两个等位基因之间的主要差异是G/T多态性，该多态性产生的差异剪接会影响Wx mRNA稳定性，导致Wx^a等位基因产生的mRNA和蛋白质水平比Wx^b高10倍，从而使籼稻产生更多的直链淀粉(一般大于25％，有的在30％以上)，而粳稻中直链淀粉含量一般为15-18％。除了这三个等位基因，近年来通过对一些自然存在的一些直链淀粉含量变化的品种的研究，也发现了其它一些复等位基因，如Wxⁱⁿ、Wx^op、Wx^mq及Wx^mp等。这些等位基因一般在序列上有一个或几个碱基的差异，这些差异会影响Wx基因的表达及GBSS的活性，从而导致直链淀粉含量及稻米品质的不同。

通过传统的育种方法也可以这些优良性状转育到当地品种中，但这种方式耗时、费力、不确定因素较多，很难在短期内对本地品种进行改良。因而需要发展新的技术和方法来加速优良品种的培育。近年来，基因编辑技术，特别是CRISPR/Cas9技术的出现，为快速培育优良新品种提供了可能。本发明通过CRISPR/Cas9技术对水稻Waxy基因进行了人工突变，并获得了直链淀粉含量5％左右的新材料，为水稻新品种改良提供基础材料。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种水稻GBSSI突变型蛋白，所述GBSSI突变型蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于水稻GBSSI氨基酸序列的第178位氨基酸发生突变。

本发明首次发现了该178位氨基酸由苏氨酸突变为异亮氨酸并改变稻米直链淀粉含量。本发明的第178位氨基酸的突变还可以包括谷氨酸、甘氨酸、色氨酸、天冬氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸以及终止密码子等19种变异类型。而关于上述的氨基酸的其他变异或提前终止是否影响淀粉合成酶活性、生理功能以及是否改变稻米直链淀粉含量，还有待进一步研究证实。

进一步地，本发明所述的水稻GBSSI突变型蛋白，其特征在于，包括：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或