[发明专利]一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，针对现有肠壁上皮细胞分离过程中蛋白酶稳定性差的问题，公开了一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法，包括：将分离所得的细胞加入培养液中，调整细胞浓度，接种到细胞培养板孔中，接种后静止培养；再把培养液连同未贴壁的细胞转入新的细胞培养板继续培养，定期更换培养液，待细胞铺满底壁，再进行传代培养。培养过程中采用的是单层细胞培养法，因为所有组织中都含有一定量的细胞间质‑纤维和基质等，对细胞生长有妨碍作用，过程中用胰蛋白酶消化能够除去间质，使组织松散，细胞相互分离，细胞易于生长，且能够获得较多较纯的肠上皮细胞，最终极大提升了细胞的生长速率及生长效果。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种黄姑鱼肠道上皮细胞的培养方法。

背景技术

细胞是生物体形态结构和功能活动的基本单位。细胞不同于非生命界的任何结构单位，其最独特的属性就是它是一个能独立生存，进行自我调节的开放体系，它同外界进行物质、能量、信息交换的条件下，处于动态平衡之中。所有生物体的细胞都具有随环境营养条件改变而做出适应性反应的能力。肠道细胞不仅承担着鱼体对营养物质消化吸收的功能，同时具有强大的免疫调节功能，是鱼类抵御肠道内有害物质和微生物的重要防线。肠道上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)是鱼类肠道的主要功能细胞，其参与肠道食物的消化、吸收、免疫屏障等功能。近年来，高密度养殖条件下鱼类肠道炎症已经成为养殖鱼类高死亡率的主要原因，严重阻碍了水产养殖业的可持续发展。鱼类肠道粘膜易与腔内大量的细菌、病毒、生物化学毒素与植物性蛋白饲料接触而发生肠道炎症损伤，引起鱼类肠道粘膜增厚并充血，肠上皮细胞滤泡消失，微绒毛变短，杯状细胞增多等症状。因此，建立体外鱼类肠上皮细胞模型对鱼类肠道炎症损伤机制的研究具有重大意义。利用体外培养鱼类肠道细胞对环境因素，包括植物性蛋白饲料抗营养因子、化学毒素、环境激素和内分泌干扰素等，进行污染监测和安全性评价，也是鱼类肠道细胞培养的重要用途之一。

黄姑鱼为海水鱼类，对养殖条件要求较高；活体养殖试验为了获得稳定的统计数据，往往要求样本大，且试验周期长，人力需求量大等。使用鱼类肠道细胞进行生理生化、肠道炎症的发生机制等研究，则具有试验周期短，试验数据获取较快，人力物力需求量不大，试验稳定性、重复性较好，能有效避免个体差异等优点。因此，开展黄姑鱼肠道细胞培养技术的探索研究，不仅能丰富黄姑鱼肠道细胞学知识及在相关基础理论研究方面具有重要意义，在黄姑鱼肠道炎症损伤机制及饲料研究开发等应用性领域亦有重要价值。

鱼类原代细胞培养方法最常用的培养方法为组织块培养法和单层细胞培养法(也即酶消化法)。传统的组织块法是将组织块剪成1mm×1mm×1mm后贴壁，让肠上皮细胞从贴壁的组织块中爬出来，但是组织块没有经过酶的消化作用，细胞爬出缓慢，耗时较长，不利于实验的开展，并且组织块上残留的结缔组织易爬出成纤维细胞，造成消化出的细胞纯度不高。因此，有效保证整个上皮细胞培养过程的有效与稳定增长具有重要的意义。

专利号CN201710816631.4，专利名称为“一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法”，本发明涉及一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。分离方法为：无菌操作取出肠道中后段，除去肠道外脂肪与肠系膜，纵向剖开肠管清除粪便，使用无菌弯头镊子刮除草鱼肠黏液与上皮细胞层，刮除时间15min；将除去黏液和上皮细胞层的肠段处理成碎块置于胶原酶IV消化液中消化，获得固有层单细胞悬液；再用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞。纯化方法为：采用差异贴壁法纯化肠巨噬细胞。原代培养方法为：用含草鱼自体血清的RPMI-1640完全培养液培养肠巨噬细胞，待细胞贴壁后用含脂多糖的RPMI-1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，细胞至少可存活20天。

其不足之处在于，上述专利中培养过程所采用的培养基为完全培养液，细胞增长所需的成分添加量和浓度未进行精准控制，对于特定细胞种类的特异性营养供给较差。

发明内容