[发明专利]一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法

说明书

本发明涉及细胞分离技术领域，针对现有肠壁上皮细胞分离过程中蛋白酶稳定性差的问题，公开了一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法，包括：将黄姑鱼浸泡在含有青霉素和链霉素的海水中禁食1‑2天；分离肠道并剪开肠壁，并放到PBS溶液中，去除肠道上脂肪和腹膜；将肠壁剪碎得到肠道组织块，再用DMEM/F12培养液清洗并离心，重复离心2‑4次；同时加入肠道组织块和固定化蛋白酶消化液，进行酶解消化；停止消化，处理后加入DMEM/F12培养液待用。引入具有负载能力强的蛋白酶载体，将消解蛋白酶固定在载体上，使得固定化蛋白酶具有较强的耐热性和更宽的pH值范围，保证固定化蛋白酶的性能稳定。

技术领域

本发明涉及细胞分离技术领域，尤其是涉及一种黄姑鱼肠道上皮细胞的有效分离方法。

背景技术

细胞是生物体形态结构和功能活动的基本单位。细胞不同于非生命界的任何结构单位，其最独特的属性就是它是一个能独立生存，进行自我调节的开放体系，它同外界进行物质、能量、信息交换的条件下，处于动态平衡之中。所有生物体的细胞都具有随环境营养条件改变而做出适应性反应的能力。肠道细胞不仅承担着鱼体对营养物质消化吸收的功能，同时具有强大的免疫调节功能，是鱼类抵御肠道内有害物质和微生物的重要防线。而肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)是鱼类肠道细胞的主要功能细胞，是抵御外界环境最重要的屏障。近年来，高密度养殖条件下鱼类肠道炎症已经成为养殖鱼类高死亡率的主要原因，严重阻碍了水产养殖业的可持续发展。鱼类肠道粘膜易与腔内大量的细菌、病毒、生物化学毒素及植物性蛋白饲料接触而发生肠道炎症损伤，引起鱼类肠道粘膜增厚并充血，肠上皮细胞滤泡消失，微绒毛变短，杯状细胞增多等症状。因此，建立体外鱼类肠上皮细胞模型对鱼类肠道炎症损伤机制的研究具有重大意义。利用体外培养鱼类肠道上皮细胞对环境因素，包括植物性蛋白饲料抗营养因子、化学毒素、环境激素和内分泌干扰素等，进行污染监测和安全性评价，也是鱼类肠道上皮细胞培养的重要用途之一。

黄姑鱼为海水鱼类，对养殖条件要求较高；活体养殖试验为了获得稳定的统计数据，往往要求样本大，且试验周期长，人力需求量大等。使用鱼类肠道上皮细胞进行生理生化、肠道炎症的发生机制等研究，则具有试验周期短，试验数据获取较快，人力物力需求量不大，试验稳定性、重复性较好，能有效避免个体差异等优点。因此，开展黄姑鱼肠道上皮原代细胞培养技术的探索研究，不仅能丰富黄姑鱼肠道细胞学知识及在相关基础理论研究方面具有重要意义，在黄姑鱼肠道炎症损伤机制及饲料研究开发等应用性领域亦有重要价值。

细胞分离技术是决定后期肠道细胞培养过程能否顺利进行的关键步骤，若细胞提取技术分离不好，最终得到的细胞液中则会含有大量肠道中的蛋白组织或者肌肉组织，使得最终无法有效的将上皮细胞从肠壁中分离出来，进而影响后续的上皮细胞培养效果。

在蛋白质消融过程中游离蛋白酶的活性受环境影响较大，因为游离酶在实际应用中存在着性质较不稳定、耐酸碱性弱、耐热性不强等诸多的局限性，同时游离酶也容易使得蛋白质消解过度或者消解不到位，使得肠道上皮细胞的分离过程难以控制，因此，有效保证蛋白酶的性能稳定对整个上皮细胞分离过程的性能稳定控制具有重要的作用。

专利号CN202010590409.9，专利名称为“一种鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法”，本发明公开了一种鱼类高脂存储肝细胞分离和培养方法。a、选取45-55d虾虎鱼幼鱼，在无菌条件下获得其肝脏组织，将肝脏组织分散成块，获得组织块；b、将孔径20μm的细胞筛置于胰蛋白酶终止液中，在孔径20μm的细胞筛上方设置有孔径50μm的细胞筛；c、将组织块置于孔径50μm的细胞筛中，持续添加胰蛋白酶液于孔径50μm的细胞筛中消化组织块，流动持续消化，收集位于孔径20μm的细胞筛上的细胞，用10％FBS清洗，获得高脂存储肝细胞；d、将高脂存储肝细胞接种到培养基中培养。本发明的高脂存储肝细胞能贴壁后稳定一周，脂肪细胞可存活1个月左右，期间可用于细胞水平的实验，从而解决鱼类成熟脂肪细胞分离和培养困难的问题。

其不足之处在于，其胰蛋白酶为游离的胰蛋白酶，其活性受环境的影响较大，蛋白消解过程难以控制。

发明内容