[发明专利]一种α-1,3-葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制备中的应用

说明书

本发明公开了一种α‑1,3‑葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制备中的应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明将来源于Thermoplasmaacidophilum的α‑1,3‑葡萄糖苷酶在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达，将所述α‑1,3‑葡萄糖苷酶TaAglA以10％葡萄糖和20％麦芽糖为底物，黑曲霉低聚糖产量最高能达到88.5g/L，转化率为29.5％。以10％麦芽糖和10％麦芽糊精为底物，黑曲霉低聚糖产量最高能达到47.4g/L，转化率为23.7％。本发明制备得到的黑曲霉低聚糖(NOS)产量远高于现有技术，并且能以较低浓度的底物进行转化，同样获得了较高的黑曲霉低聚糖(NOS)转化率和产量，有利于拓宽黑曲霉低聚糖的底物范围和降低生产成本。

技术领域

本发明涉及一种α-1,3-葡萄糖苷酶在黑曲霉低聚糖制备中的应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

黑曲霉低聚糖(Nigerooligosaccharides，NOS)是一类含有α-1,3键的α-D-葡萄糖寡聚物，由于这种糖最早在日本的发酵清酒中被发现有少量存在，又称Sakebiose，其成分主要包括黑曲霉二糖、黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖和黑曲霉糖基麦芽糖等。与其他低聚糖相比，黑曲霉低聚糖具有特殊醇香风味、低黏度、低甜度(约是蔗糖的45％)等特点，是清酒、豆酱等发酵型产品具有特殊的良好口感的主要原因。它可代替砂糖加入各种饮料中以增加厚味，降低高甜度甜味剂的异味、苦味，同时具有协调咸味和在低盐下保持与增强鲜味的效果，对以鲜味为主体的各种饮料食品有味质调节效果。此外，黑曲霉低聚糖还具备预防龋齿、促进双歧杆菌增殖调节肠道健康、改善脂质代谢等生理功效，以及使T淋巴球和B淋巴球等免疫细胞活性化的免疫激活作用。

黑曲霉低聚糖的生产方法主要有化学合成、多糖水解法和酶催化转糖苷法3种。α-葡萄糖苷酶催化的葡萄糖基转移反应是食品工业生产低聚异麦芽糖和黑曲霉低聚糖的重要反应，GH31家族α-葡萄糖苷酶是具有高转苷活性的一类α-葡萄糖苷酶，但目前该家族α-葡萄糖苷酶的应用研究主要集中于催化合成α-1,6糖苷键制备低聚异麦芽糖方面，对α-1,3糖苷键具有高度选择性的α-葡萄糖苷酶报道较少。目前已报道的具有α-1,3糖苷键合成能力的α-葡萄糖苷酶主要来源于真菌，如Acremoniun sp.S4G13分泌转化酶以麦芽糖为底物催化制备黑曲霉低聚糖的转化率可达37％，但其糖浆产品整体浓度仅20g/L(NOS约7.4g/L)，生产效率较为低下，且合成产物主要为黑曲霉二糖和黑曲霉糖基麦芽糖，而黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖以及DP≥4的黑曲霉糖基麦芽低聚糖则含量较低。本发明的目的在于利用一种细菌来源的α-1,3-葡萄糖苷酶提高黑曲霉低聚糖的产量及转化率，同时提升所制备黑曲霉低聚糖组分中黑曲霉三糖、黑曲霉糖基葡萄糖的含量比例。

发明内容

α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)可催化麦芽低聚糖、异麦芽糖、α-葡聚糖等底物的非还原末端释放α-D-葡萄糖，或通过转糖基作用将葡萄糖基从供体底物转移至糖基受体生成低聚糖或糖苷衍生物。

本发明提供了一种重组大肠杆菌，表达Thermoplasmaacidophilum来源的α-1,3-葡萄糖苷酶，所述α-1,3-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，以pET24a为表达载体。

在一种实施方式中，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

本发明提供了一种制备黑曲霉低聚糖的方法，所述方法是利用氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的α-1,3-葡萄糖苷酶，或所述重组大肠杆菌表达的α-1,3-葡萄糖苷酶，以麦芽糖、葡萄糖或麦芽糊精中的一种或几种为底物，合成黑曲霉低聚糖。

在一种实施方式中，以麦芽糖和葡萄糖的混合物为底物，麦芽糖的浓度为100-200g/L，葡萄糖的浓度为100-200g/L。

在一种实施方式中，麦芽糖和葡萄糖的浓度均为100g/L，或葡萄糖的浓度为100g/L、麦芽糖的浓度为200g/L。