[发明专利]一种包含糖醇和ATP结合域的基因序列及其在解脂亚罗酵母中表达和功能验证方法

说明书

本发明公开了一种包含糖醇和ATP结合域的基因序列以及含该序列的解脂亚罗酵母重组菌株的构建方法，属于微生物基因工程领域。所述的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因在解脂亚罗酵母菌中表达后，重组菌株对酵母菌种赤藓糖醇和核糖等碳水化合物的同化性能差异显著，故推定该基因为具有赤藓糖醇合成调控能力的新基因。重组后的解脂亚罗酵母菌株，还表现出对正常解脂亚罗酵母赤藓糖醇发酵液提取后的母液中多种糖醇和一些非发酵性二糖的同化能力，这对改进解脂亚罗酵母的底物利用能力和赤藓糖醇生产过程废液综合利用具有实际应用价值。

技术领域

本发明属于酵母基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种包含糖醇和ATP结合域的基因序列和含此序列的重组菌株构建方法以及重组菌株功能验证方法。

背景技术

自然界中赤藓糖醇广泛存在于酵母、藻类、蘑菇等微生物中，属于糖醇类天然甜味剂，热量极低，不易吸湿，高温时也稳定且具有一定的抗氧化活性，在人体代谢中不引起胰岛素水平变化，食用后不对血糖造成较大浮动。口腔中的细菌一般不利用此类甜味剂，长期食用不会引起龋齿。因此，赤藓糖醇可作为功能性代糖添加至无卡或低卡食品中，应用于医药产品也更适合肥胖症和糖尿病患者。常用微生物发酵法生产赤藓糖醇，主要以小麦、玉米等淀粉质原料经酶降解为葡萄糖，再由耐高渗酵母如毕赤氏酵母属（Pichia），耶氏酵母属（Yarrowia），假丝酵母属（Candida），球拟酵母属（Torulopsis），三角酵母属（Trigonopsis）等作为生产菌株，通过以葡萄糖为底物的发酵及后续过滤分离纯化等步骤得到赤藓糖醇，平均得率约50％，因具备较高的生产效率、反应温和且成本低而进行工业化的大批量生产。

解脂亚罗酵母主要以葡萄糖和甘油为发酵底物合成赤藓糖醇。在以葡萄糖为碳源的合成代谢途径中，经糖酵解，己糖激酶催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖进入磷酸戊糖途径生成4-磷酸赤藓糖，在4-磷酸赤藓糖激酶和赤藓糖还原酶的催化下生成赤藓糖醇。宿主菌解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）是一种安全的非致病性菌株，已完成全基因组和线粒体测序，基因操作手段完善，能利用廉价底物和多种碳源分泌代谢产物，可通过定向分流代谢途径来生产具有一定工业价值的化合物，逐渐成为一种酵母表达系统并广泛应用于食品和医药生产中。

发明内容

本发明公开了一种包含糖醇和ATP结合域的基因序列：

① 该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由1831个核苷酸组成。

② 由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经替换、增添、缺失一个或多个核苷酸得到编码相同功能基因的序列。

③与SEQ ID NO.1所示序列具有75%以上同源性的编码相同功能基因的序列。本领域技术人员可采用已知方法，例如点突变对本发明基因序列进行突变，经过人工修饰的具有与本发明提供的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸序列，只要与该基因序列编码蛋白有相同功能，均是衍生于本发明的基因序列并且等同于本发明序列。

“同一性”是指与本发明核苷酸序列的相似性。“同一性”包括与本发明SEQ IDNo.1所示序列具有75%或更高同源性的核苷酸序列。同一性可以用计算机序列比对软件或通过BLAST算法对序列同源性进行评价，两个或多个序列之间的同一性用百分比表示。

本发明所述的基因序列表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由603个氨基酸组成。对SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，进行不超过10个氨基酸残基的替代、缺失、增添得到的具有相同功能的蛋白，或与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有75%或更高同源性且具有相同功能的蛋白，均是衍生于本发明的氨基酸序列并等同于本发明序列。