[发明专利]一种可用于双模态成像的腺相关病毒及其应用

说明书

本发明公开了一种可用于双模态成像的腺相关病毒及其应用。在AAV载体质粒的ITR中间依次插入CAG启动子、AQP1基因、2A连接序列、EGFP基因、WPRE转录后调控元件以及polyA序列。将制备的重组腺相关病毒感染动物活体神经细胞后，可在神经细胞内介导AQP1与EGFP蛋白的表达，从而使表达区域具有绿色荧光信号，同时可导致扩散加权MRI信号改变，从而具有双模态成像的特征。本发明公开的病毒载体转导的外源基因的表达水平可通过无创的磁共振成像在活体组织原位观察，也可通过荧光成像在离体组织中观察，可用于磁共振成像造影、神经元标记、神经环路示踪等。

技术领域

本发明属于病毒载体技术领域，具体涉及一种携带1型水通道蛋白与绿色荧光蛋白融合基因的腺相关病毒及其应用。

背景技术

通过非侵入性的成像方法检测活体动物内基因的表达对于基因转导、基因治疗、细胞移植、细胞治疗等领域非常关键，另外活体内检测基因表达的方法将有助于基础的生物学研究。在进行基因转导或细胞移植时，通常会使用一种报告基因来标记目标基因或感兴趣基因的表达。目前，最常用的报告基因是基于荧光蛋白与化学发光蛋白的基因。由于光线难以穿透深层组织，光学成像很难在活体水平获得不透明的深部组织的基因表达结果，因此，现有的研究中，大部分基因的表达是通过离体的光学成像显示，如使用绿色荧光蛋白EGFP基因作为报告基因，使用荧光成像观察基因表达结果。离体的光学图像可以达到良好的空间分辨率和灵敏度，但其结果无法显示基因表达在活体内的水平，也无法实现对同一个实验对象进行多次观测的长时程实验。

磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)是一种综合了非侵入性、无电离辐射、高穿透性、适用于软组织等多种优势的成像方法，已被广泛运用于临床诊断与科学研究。并且对于人体以及目前常用的哺乳类模式动物(大小鼠)MRI可实现较高的时空分辨率。因此，已有大量的研究着力于构建或定义基于磁共振成像的报告基因。目前，基于磁共振成像造影的报告基因主要分为两大类。一类是基于金属蛋白和金属离子转运蛋白，它们主要通过富集顺磁性的金属离子来增强弛豫，从而导致T1或T2加权信号的变化。另一类是基于化学交换饱和转移，通过可交换的质子以及化学交换饱和转移的原理来产生MRI对比。其中第一类报告基因的局限是金属离子的生物可用度，以及金属离子的毒性。第二类的报告基因的局限是检测灵敏度偏低，需要大量表达(2.5μM)才能产生可观测的造影效果。

近年来，有文献报道水通道蛋白(Aquaporin,AQP)基因也可作为磁共振成像报告基因，过表达AQP1蛋白可产生DWI-MRI信号的改变，并且不会对细胞或组织造成明显的伤害。弥散加权成像(Diffusion-weighted imaging，DWI)是广泛应用的成熟MRI技术，在基础的生物生理学研究和疾病的诊断中具有应用。DWI通常是通过施加一对梯度磁场以使扩散的水分子中自旋散相，从而产生扩散加权对比度。水通道蛋白是一组高度保守的跨膜转运蛋白，以四聚体的形式富集于细胞膜，它表达于多种类型的细胞中，对水具有高度选择通透性。根据文献报道，过表达1型水通道蛋白(AQP1)可促进水的跨膜扩散，从而增强DWI MRI的对比度，在DWI-MRI图像上呈现暗信号，而在表观扩散系数ADC map上呈现高信号。作为MRI报告基因，AQP1的灵敏度较高(500nM)，并且不依赖于金属离子，从而规避了前述两类报告基因的缺陷。

目前，尚没有直接利用病毒载体携带AQP1基因用于活体动物水平MRI成像造影的报道。病毒作为基因载体可介导外源基因在多种类型的细胞中表达，可通过分子元件限制外源基因在特异类型细胞中表达，并可能通过药物控制外源基因在特定时间段内表达(条件性表达)。在众多类型的病毒载体中，重组腺相关病毒载体(rAAV)具有、毒性低、免疫原性低、感染宿主范围广、携带外源基因表达稳定持久等优势，因此已被广泛应用于神经环路示踪以及基因治疗中。根据本实验室前期探索的结果，相较于常用的嗜神经病毒载体单纯疱疹病毒HSV、水泡型口炎病毒VSV，rAAV载体可在动物体内表达时间更长，从而更高的表达量。并且AAV包装周期短，能更快地获得纯化的病毒用于活体实验。