[发明专利]一种DNA纳米结构标记细胞目的蛋白的荧光染色方法

说明书

本发明属于超分辨显微成像技术领域，具体为一种DNA纳米结构标记细胞目的蛋白的荧光染色方法。其用链霉亲和素作中间物，将DNA纳米结构和修饰有生物素的目的蛋白的抗体连接在一起，从而标记目的蛋白；其中：所述DNA纳米结构上同时修饰有生物素、锚定在水凝胶上的基团和两个以上荧光染料分子。本发明的DNA纳米结构除修饰同一种染料时，其亮度非常高，得到的显微图片质量会大幅提高。当修饰STED超分辨显微技术优势染料时，则膨胀显微技术能够与STED超分辨技术很好地结合。当修饰荧光共振能量转移的染料对时，能使DNA纳米结构有闪烁的性质，使膨胀显微技术更加方便地与STORM和SOFI超分辨技术结合。

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种DNA纳米结构标记细胞目的蛋白的荧光染色方法。

背景技术

膨胀显微成像技术是通过荧光特异性标记目标物，如蛋白、DNA、RNA等，将荧光基团锚定在水凝胶上，当水凝胶在水里膨胀的时候，本来在光学衍射极限内靠在一起无法区分开的荧光分子随着胶一起膨胀，它们彼此之间的距离增大，这样就能够用普通的显微成像设备获取分辨率更高的图像。因为膨胀显微成像技术的操作简单，原材料易得，所以它在单细胞动物、细胞系、组织甚至动物体重都有着广泛的应用。

样品各向同性地均匀地膨胀，是保证样品结构不会畸变的重要条件。要保证均匀膨胀，蛋白酶要尽可能将样品中维持生物体结构的蛋白消化完全，以减少结构之间的拉扯力。但是，如果消化过头，荧光蛋白的荧光基团会被蛋白酶打断，连接在抗体上的染料也会脱落，在膨胀过程中，没有锚定在水凝胶上的荧光分子会被洗掉，而且在凝胶形成过程中产生的自由基也会破坏荧光基团。以上这些原因导致荧光信号的大量损失，样品的有效标记密度低会严重影响成像质量。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种DNA纳米结构标记细胞目的蛋白的荧光染色方法。该方法以链霉亲和素和生物素为媒介，利用DNA纳米结构具有多端点（游离基）可以修饰多个荧光染料的优势以及将不被蛋白酶消化的特性对目的蛋白进行标记，不仅能够克服现有膨胀显微技术中样品被蛋白酶消化导致的样品荧光信号大量损失的缺点，而且能够大大提高荧光标记的亮度，使显微图片信噪比更高，图片质量更好。如果修饰同一种染料，该DNA纳米结构的亮度将非常高，得到的显微图片质量会大大提高。如果修饰的染料分子是STED超分辨显微技术优势染料，则膨胀显微技术能够与STED超分辨技术很好地结合。如果修饰荧光共振能量转移的染料对，还能使DNA纳米结构有闪烁的性质，使膨胀显微技术更加方便地与STORM和SOFI超分辨技术结合。

为达到上述目的，本发明采取下述技术方案。

一种DNA纳米结构标记细胞目的蛋白的荧光染色方法，其用链霉亲和素作中间物，将DNA纳米结构和修饰有生物素的目的蛋白的抗体连接在一起，从而标记目的蛋白；其中：所述DNA纳米结构上同时修饰有生物素、锚定在水凝胶上的基团和两个以上荧光染料分子。

本发明中，DNA纳米结构为DNA双链结构、DNA四面体结构或其他更复杂的空间结构。

本发明中，荧光染料分子为同一种或不同种。相较于其他用于膨胀的DNA分子，本发明的DNA纳米结构有多顶点优势，除了生物素和丙烯酰胺基占据了两个顶点，其余的顶点都可以修饰荧光染料。如果修饰同一种染料，该DNA纳米结构的亮度将非常高，得到的显微图片质量会大大提高。如果修饰的染料分子是STED超分辨显微技术优势染料，则膨胀显微技术能够与STED超分辨技术很好地结合。如果修饰荧光共振能量转移的染料对，还能使DNA纳米结构有闪烁的性质，使膨胀显微技术更加方便地与STORM和SOFI超分辨技术结合。

本发明中，DNA纳米结构中锚定在水凝胶上的基团有且不限于丙烯酰胺基团等。

本发明中，涉及到免疫荧光过程，但是所用的抗体带的不是荧光基团，而是生物素，所要标记的目的蛋白的一抗上连有生物素，或者是二抗上连有生物素。

本发明中，DNA纳米结构标记细胞目的蛋白的荧光染色方法的具体步骤如下：