[发明专利]一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法。具核梭杆菌与多种疾病密切关联，近期研究表明其可促进结直肠肿瘤发生发展。但目前还缺乏一种精确、直观的检测方法用来区别具核梭杆菌的不同亚种。具核梭杆菌不同亚种在生物学特性、定植及致病能力上均存在差异，因此精确的亚种鉴定对于了解其致病机制具有深远意义。本发明提供了一组用于鉴定具核梭杆菌亚种的特异性DNA序列，并设计了相应的检测引物，阐述了其在亚种水平检测和鉴定具核梭杆菌的应用。该发明可促进揭示病灶中具核梭杆菌的亚种构成及来源，将有助于探究不同亚种与疾病间的关系，及相关流行病学特征。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法，尤其涉及一组具核梭杆菌亚种特异性DNA序列，并阐述了其在具核梭杆菌亚种水平检测和鉴定方面的应用。

背景技术

具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)是口腔中常见的定植菌，在特定条件下参与多种口腔疾病，如牙周炎、口腔肿瘤等。具核梭杆菌还可播散至口腔以外的其他身体部位，并引起多种与细菌感染相关的疾病，包括冠心病、肝脓肿、炎症性肠病、早产等各种妊娠并发症。尤其，近期发现结直肠癌患者的肿瘤组织及粪便中存在高丰度具核梭杆菌，且存在多种机制促进结直肠肿瘤发生发展，表明具核梭杆菌与结直肠肿瘤存在密切关联。

具核梭杆菌目前分为四个亚种，包括具核亚种(F.nucleatum subsp.nucleatum)、多形亚种(F.nucleatum subsp.polymorphum)、文氏亚种(F.nucleatum subsp.vincentii)和动物亚种(F.nucleatum subsp.animalis)。不同亚种具核梭杆菌的生物学习性、致病能力存在差异。但因缺乏有效的鉴别手段，不同亚种与疾病间的关系仍未得到充分的研究。具核梭杆菌单一菌株的亚种鉴定可通过对特定遗传标记基因(如16S rRNA基因、rpoB基因等)测序后经序列比对或进化分析完成。目前也有研究开发了基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的方法，但该方法需要有特定的昂贵设备，且准确度(约80％)存在一定欠缺。这些方法在分离培养成功后方可使用，而针对诸如粪便、肠道组织等含有大量混合菌体的样本，分离培养技术仍存在很大的限制，使得基于这类样本的分离培养需要较大的人力物力投入。此外，在这类样本中常用的16S rRNA基因扩增子测序、宏基因组测序等高通量测序技术尚无法达到亚种水平鉴定。

因此，目前还缺乏一种精确、直观的检测方法用来区别具核梭杆菌的不同亚种。具核梭杆菌不同亚种在生物学特性、定植及致病能力上均存在差异，因此精确的亚种鉴定对于了解其致病机制具有深远意义。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种具核梭杆菌的亚种检测和鉴定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一组特异性DNA序列在检测和鉴定具核酸杆菌亚种中的应用，所述特异性DNA序列包括SR-n1、SR-n2、SR-n3、SR-n4、SR-n5、SR-n6、SR-a1、SR-v1、SR-p1、SR-p2、SR-p3中的至少一种；

所述SR-n1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SR-n2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述SR-n3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SR-n4的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述SR-n5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SR-n6的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述SR-a1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SR-v1的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述SR-p1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述SR-p2的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；所述SR-p3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

优选地，所述特异性DNA序列包括：