[发明专利]一种低表达CD7的NK细胞制备方法

权利要求书

1.一种制备CD56+NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）从脐带血分离单个核细胞；

2）分选获得CD34+细胞；

3）将细胞分选后用X-VIVO培养基重悬细胞，X-VIVO培养基是由X-VIVO、10ng/ml IL-7、20ng/ml IL-15、10ng/ml SCF、10ng/ml FLt3L以及5%人AB血清组成；

4) NK细胞的诱导分化，将细胞继续培养10-14天后，将培养基换为581活化培养基继续培养1周后， 将培养基换为581扩增培养基继续培养细胞，每隔2-3天采用半换液的方式进行换液；

581活化培养基是由KBM581、100ng/ml OK432、1000IU/ml IFN-γ、1000 IU/ml IL-2、100ng/ml IL-15、100ng/ml IL-21以及5%人AB血清组成；

581扩增培养基是由KBM581、1000IU/ml IL-2、100ng/ml IL-15、100 ng/ml IL-21以及5％人AB血清组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从脐带血分离单个核细胞的步骤包括：利用生理盐水稀释脐带血，加入淋巴细胞分离液，离心收集白膜层细胞；生理盐水稀释白膜层细胞后离心弃上清；加入红细胞裂解液裂解细胞，离心弃上清；重悬细胞沉淀。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用生理盐水以1：1比例稀释脐带血。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用生理盐水以1：1比例稀释白膜层细胞。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，从脐带血分离单个核细胞的步骤包括：利用生理盐水以1：1比例稀释脐带血，加入稀释后脐带血1/2体积的淋巴细胞分离液；2000r/min，离心20min；收集白膜层细胞，然后加入生理盐水以1：1比例进行稀释；将细胞以2000r/min，离心5min，弃掉上清；用5ml红细胞裂解液裂解细胞5min，随后将细胞以2000r/min，离心5min，弃掉上清；用5-10ml的DPBS重悬细胞计数，计算所得到的细胞数。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分选CD34+细胞的步骤包括：将单个核细胞用分选缓冲液重悬，依次加入FCR阻滞剂和CD34磁珠混匀，低温孵育；孵育后的细胞中加入分选缓冲液离心弃上清；用分选缓冲液重悬后加入分选柱中；分选柱中加入分选缓冲液冲洗后，将分选缓冲液加入到分选柱中，将柱塞推到分选柱底端，将标记的细胞冲洗下来，计数。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，低温孵育是指4℃冰箱孵育30min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，分选缓冲液是指0.5% HSA。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，分选CD34+细胞的步骤包括：将细胞以300g/min，离心10min，弃掉上清，用300μl的0.5% HSA重悬细胞，随后依次加入100μl FCR阻滞剂和CD34磁珠，每加入一种东西混匀细胞一次，随后将50ml离心管放入4℃冰箱孵育30min，每隔5min混匀一次细胞；将孵育好的细胞中加入5-10ml 0.5% HSA，将细胞以300g/min，离心10min，弃掉上清；用500μl 0.5% HSA 重悬细胞，随后将细胞加入到分选柱中，分选柱需要提前用3ml 0.5% HSA润洗一遍；向分选柱中加入3ml 0.5% HSA冲洗分选柱3次；随后将分选柱从磁场中移出，将5ml 0.5% HSA加入到分选柱中，用力将柱塞推到分选柱底端，将标记的细胞冲洗下来，计数。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将细胞分选后用X-VIVO培养基重悬细胞，并把细胞铺到24孔板中，调整细胞密度为0.8-1.2×10⁵个/孔。